分子生物学问答题.docx

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1、1. 什么是转座? 转座因子在一个DNA分子内部或者两个DNA之间不同位置间的移动。2. 病毒基因组有哪些特点?答：不同病毒基因组大小相差较大；不同病毒基因组可以是不同结构的核酸；除逆转录病毒外，为单倍体基因组；病毒基因组有的是连续的，有的分节段；有的基因有内含子；病毒基因组大部分为编码序列；功能相关基因转录为多顺反子mRNA有基因重叠现象。3. 原核生物基因组有哪些特点? 答：基因组由一条环状双链DNA组成；只有一个复制起始点；大多数结构基因组成操纵子结构；结构基因无重叠现象；无内含子，转录后不需要剪接；基因组中编码区大于非编码区；重复基因少，结构基因一般为单拷贝；有编码同工酶的等基因；基因

2、组中存在可移动的DNA序列；非编码区主要是调控序列。4. 真核生物基因组有哪些特点? 答：每一种真核生物都有一定的染色体数目；远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；真核生物基因转录为单顺反子；有大量重复序列；真核基因为断裂基因；非编码序列多于编码序列；功能相关基因构成各种基因家族。5. 基因重叠有什么意义?答：利用有限的核酸储存更多的遗传信息，提高自身在进化过程中的适应能力。6. 质粒有哪些特性? 答：在宿主细胞内可自主复制；细胞分裂时恒定地传给子代；所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；质粒可以转移。7. 什么是顺式作用元件? 答：基因中能影响基因表达，但不编码RNA和蛋白质的DNA序

3、列。顺式作用元件主要包括启动子、增强子、负调控元件等。8. 简述原核基因表达的特点。 答：(1)只有一种RNA聚合酶。(2)原核生物的基因表达以操纵子为基本单位。(3)转录和翻译是偶联进行的。(4)mRNA：翻译起始部位有特殊的碱基序列-SD序列。(5)原核生物基因表达的调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控。9. 简述因子在原核基因表达调控中的意义。 答：(1)6因子含有识别启动区的结构域调控RNA聚合酶与DNA结合，确保RNA聚合酶与特异启动区而不是其他位点的稳定结合(2)6因子使得RNA聚合酶选择一套特定启动区起始转录。一旦一种6因子被另一种代替，即引起原来一套基因转录的关闭和新的一套

4、基因转录的开届。10. 在有乳糖而无葡萄糖的条件下，乳糖操纵子是如何调控转录起始的？答：无葡萄糖时，cAMP处于高水平，与CAP形成cAMP-CAP复合物并结合到启动子上游的CAP位点，乳糖存在阻遏蛋白不与操纵基因结合，cAMP-CAP复合物与lac操纵子的调控元件结合后，促进结构基因的转录。11. 简述乳糖操纵子的结构。 答：编码-半乳糖苷酶、半乳糖苷通透酶和硫代半乳糖苷转乙酰基酶的基因Z、Y、A称为结构基因，结构基因加上调控元件：启动子P和操纵基因O及CAP结合位点，lac阻遏蛋白基因I，即构 成乳糖操纵子。12. 原核生物可以通过哪几个层次的表达调控以适应环境的改变？ 答：(1)转录起始

5、的调控：6因子调控转录起始；转录起始的负调控；转录起始的正调控；转录起始的复合调控。(2)转录终止的调控：依赖因子的终止调控，通过因子的作用使转录终止；不依赖因子的终止调控；核糖体调控转录终止。(3)翻译水平的调控：反义RNA的调控作用；RNA的稳定性；蛋白质合成中的自身调控。13. 简述真核基因表达的特点 答：(1)细胞的全能性：所谓全能性是指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组DNA。(2)基因表达的时间性和空间性：高等生物的各种不同细胞具有相同的基因组，但在个体发育的不同阶段，基因表达的种类和数量是不同的，在不同组 织和器官中，基因表达的种类和数量不同。(3)转录和翻译分开进行：在核中

6、转录生成mRNA穿过核膜至胞质指导蛋白质合成。(4)初级转录产物要经过转录后加工修饰。(5)不存在超基因式操纵子结构：真核生物基因转录产物为单顺反子，一条mRNA只翻译一种蛋白质。(6)部分基因多拷贝。14. 真核生物基因组DNA水平的表达调控包括哪几种方式? 答：(1)染色质的丢失；(2)基因扩增；(3)基因重排；(4)基因的甲基化修饰；(5)染色质结构对基因表达的调控作用。15. 列举几种真核基因的顺式作用元件 答：(1)启动子：Hogness(TATA)盒，CAAT盒；(2)增强子：SV40病毒中，位于早期启动子5上游约200 bp，内含2个72bp的重复序列，其核心序列为GGTGTGG

7、A_AAG：(3)沉默子：SV40中的AGITiTIT序列为终止转录调控元件。16. 简述反式作用因子的基本结构特点。答：一个完整的反式作用因子通常含有三个主要功能结构域，分别为DNA识别结合域、转录活化域和结合其他蛋白质的调节结构域。这些结构域含有几十到几百个氨基酸残基。不同的结构域有自己的特征性结构。(1)DNA识别结合域：锌指结构、碱性亮氨酸拉链、同源结构域、螺旋-环-螺旋结构、碱性螺旋。(2)转录活化结构域：酸性-螺旋、富含谷氨酰胺的结构域、富含脯氨酸结构域。17. 简述真核生物转录水平的调控机制。答：主要通过反式作用因子与顺式作用元件和RNA聚合酶(RNA polymerase，RN

8、A p01)的相互作用完成。(1)顺式作用元件(cisacting element)指某些能影响基因表达但不编码新的蛋白质和RNA的DNA序列，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件(沉默子等)。(2)反式作用因子(transacting factor)指能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件8-12bp核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质，也称序列特异性DNA结合蛋白(sequence specific DNA binding protein，SDBP)，这是一类细胞核内蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域。（3）反式作用因子的活性调节：反式作用因子的活性调节：真核基因转

9、录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。反式作用因子的激活方式如下：表达式调节；共价修饰；配体结合；蛋白质与蛋白质相互作用 反式作用因子作用方式：成环；扭曲；滑动；Oozing反式作用因子的组合式调控：基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。18. 简述基因表达调控的意义及基本调节层次。答：(1)在同一机体的各种细胞中虽然含有相同的遗传信息即相同的结构基因，但它们并非在所有细胞中都同时表达，而必须根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因。通常情

10、况下，真核生物细胞只有215的基因处于有转录活性的状态。为了适应环境的变化，生物体需要不断的调节和控制各种基因的表达。(2)基因表达的调控是一个十分复杂的过程。从DNA上的遗传信息到蛋白质功能发挥的整个过程中，存在着基因组、转录、转录后、翻译及翻译后多个水平的调控环节。19. 举例说明什么是管家基因及其基因表达特点。答：(1)管家基因(housekeeping genes)是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。(2)管家基因表达水平受环境因素影响较小，在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化

11、很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受基他机制调节a调控区多呈低甲基化。20. 简述真核生物在翻译水平上的调控。答：(1)翻译起始的调控：翻译起始因子的功能调控：eIF-2是蛋白质合成过程中重要的起始因子。有些物质可以影响eIF-2的活性，调节蛋白质合成的速度。培养的真核细胞处于营养不足(“饥饿”)时，elF-2失活，最终导致肽链合成起始效率降低。阻遏蛋白的调节作用：所有进入胞浆的mRNA分子并不是都可以立即与核糖体结合翻译成蛋白质。由于存在一些特定的翻译抑制蛋白可以与一些mRNA的5端结合，从而抑制了蛋白质翻译。5AUG对翻译的调节作用以真核mRNA为模板的翻

12、译开始于最靠近其5端的第一个AUG。90以上的真核mRNA符合第一AUG规律。但在有些mRNA中，在起始密码子AUG的上游(5端)非编码区有一个或数个AUG，称为5AUG。5AUG的阅读框通常与正常编码区的阅读框不一致，不是正常的开放阅读框a如果从5AUG开始翻译，很快就会遇到终止密码子。因此，若从5AUG开始翻译，就会翻译出无活性的短肽。mRNA 5端非编码区长度对翻译的影响：起始密码AUG上游非编码区的长度可以影响翻译水平。当第一个AUG密码子离5端帽子的位置太近时，不容易被40S亚基识别。当第一个AUG密码子距5端帽子结构的距离在12个核苷酸以内时，有一半以上的核糖体40S亚基会滑过第个

13、AUG。当5端非编码区的长度在1780核苷酸之间时，体外翻译效率与其长度成正比。所以，第一个AUG至5端之间的长度同样影响翻译起始效率和翻译起始的准确性。(2)mRNA稳定性调节：mRNA的稳定性是翻译水平调控的重要因素，是由于mRNA是翻译蛋白质的模板，其量的多少直接影响蛋白质合成的量。mRNA半衰期越长，翻译效率越高，在细胞内合成蛋白质的量愈多。(3)小分子RNA对翻译的调控作用：如lin-4 RNA由lin-4基因编码，可阻抑lin-14蛋白质(一种核蛋白)，从而调控生长发育的时间选择。21. 简述真核基因转录因子分类及功能。答：(1)反式作用因子指能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元

14、件8-12 bp核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质，有时也称转录因子。(2)目前发现的转录因子有近百种，根据其作用方式的不同分为三类： 通用转录因子：系多数细胞普遍存在的一类转录因子，如TATA box结合因子TFD、C-X：box结合因子SPl等；组织特异性转录因子：在很大程度上，基因表达的组织特异性取决组织特异性转录因子的存在；诱导性反式作用因子：这些反式作用因子的活性能被特异的诱导因子所诱导，这种活性的诱导可以是新蛋白的合成。22. 简述真核和原核基因表达调控共同的要素。答：(1)DNA元件：具有调节功能的DNA序列 原核：启动序列，操纵序列 真核：顺式作用元件，启动子，增强

15、子，抑制子 (2)调节蛋白：原核：阻遏蛋白：负性调节；激活蛋白：正性调节 真核：转录因子基本转录因子、激活因子、抑制因子(3)RNA聚合酶：RNA聚合酶主要是通过识别与结合启动子，参与基因转录起始调控23. 说明阻遏蛋白在原核基因表达调控中的普遍意义。答：阻遏蛋白通常是与基因操纵区结合，减弱或阻止其调控的基因转录，其介导的调控方式为负调控。如大肠埃希菌乳糖代谢，在没有诱导剂时，与lac相邻(上游端)的调节基因I的产物-lac阻遏蛋白，能与操纵子操纵基因O特异地结合，抑制结构基因的转录。24. 请解释正性调节在真核基因表达调控中的普遍意义。答：在真核细胞中，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本

16、上不能靠其自身来起始转录，而是需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍；真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之：真核基因表达以正性调控为主导。25. 简述乳糖操纵子在有葡萄糖存在而没有乳糖存在时进行转录起始负调控的原理。 答：由于在没有乳糖的条件下，lac阻遏蛋白能与操纵基因特异地结合，抑制了结构基因的表达。26. DNA的损伤原因是什么? 答：DNA的损伤原因包括三大类：(1)DNA分子的自发性损伤：

17、DNA的自发性化学变化。DNA复制产生的误差；(2)物理因素引起的DNA损伤：紫外线照射引起的DNA损伤；电离辐射引起的DNA损伤。(3)化学因素引起的DNA损伤：烷化剂对DNA的损伤；碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤。27. 简述DNA分子的自发性损伤。答：DNA分子的自发性损伤包括两大类：(1)DNA复制产生的误差；(2)DNA的自发性化学变化包括碱基的异构互变、碱基的脱氨基作用、脱嘌呤 与脱嘧啶、碱基修饰与链断裂。28. 简述物理因素引起的DNA损伤。答：物理因素引起的DNA损伤有：(1)紫外线照射引起的DNA损伤。当DNA受到最易被其吸收波长(260nm)的紫外线照射时，同一条DNA链

18、上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环连成二聚体，其中最容易形成的是T-T二聚体。(2)电离辐射引起的DNA损伤：有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应是指DNA周围其他分子吸收射线能量而产生具有很高反应活性的自由基，进而损伤DNA。29. 简述电离辐射可导致的DNA分子变化。答：电离辐射可导致DNA分子的多种变化：(1)碱基变化：主要是由-OH自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落，一般嘧啶比嘌呤更敏感。(2)脱氧核糖变化：脱氧核糖上的每个碳原 子和羟基上的氢都能与-OH反应，导致

19、脱氧核糖分解，最后引起DNA链断裂。(3)DNA链断裂：这是电离辐射引起的严重损伤事件，断裂数随照射剂量而增加。射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DSIA链断裂。(4)交联：包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。30. 简述哺乳动物中DNA损伤的修复类型。答：对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。目前，已在哺乳动物细胞中发现了四个较为完善的DNA修复通路，分别是核苷酸切除修复(nucleotideexcision repair，NER)、碱基切除修复(baseexcision repair，BER)、 重组修复(recombination repair)和错配

20、修复(mismatch repair)31. 简述E.coli错配修复机制 答：在E.coi中，错配修复蛋白MutS二聚体沿着DNA运动，能够发现DNA骨架因非互补碱基对之间的不对称而产生的变形，从而识别错配核苷酸。 MutS在错配位点夹住DNA，利用ATP水解释放的能量使DNA形成扭结，MutS自身构象也发生改变。随后，MutS错配DNA复合物募集该修复系统的第二种蛋白因子MutL,MutL再激活内切核酸酶MutH在错配位点附近切断错配核苷酸所在的一条DNA链，在解旋酶UvrD和外切核酸酶作用下，将包括错配核苷酸在内的一条单链DNA去除，所产生的单链DNA缺口由DNA聚合酶填补DNA连接酶封

21、口，完成错配修复。32. 以人为例，简述碱基切除修复机制 答：在人细胞核中已经发现八种DNA糖苷酶，他们参与碱基切除修复，具有损伤特异性，通常嘧啶的氧化损伤由hNTHI、hNEILI或hNEIL2移除，而嘌呤的氧化损伤由hOGGI移除。特异识别的异常碱基包括：胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶、氧化的鸟嘌呤、脱氨基的腺嘌呤、开环碱基以及碳原子之间双键变成单键的碱基等。APE1蛋白酶的作用是修复AP位点，它从AP位点的5端切开，再去除无碱基的残基，然后由DNA聚合酶及连接酶插入个新合成的碱基，完成修复过程。33. 简述Ecoli核苷酸切除修复机制。答：Ecoli的核苷酸切除修复主要由四种蛋白组成：UvrA

22、、UvrB、UvrC、UvrD。两个UvrA分子和一个UvrB分子组成复合物结合于DNA，并消耗ATP沿着DNA链移动，UvrA能够发现损伤造成的DNA双螺旋变形，由UvrB负责解链，在损伤部位形成单链区，并使之弯曲约130度，接着UvrB募集内切核酸酶UvrC，在损伤部位的两侧切断DNA链，其中一个切点位于损伤部位5侧八个核苷酸处，而另一个切点位于3侧四或五个核苷酸处。然后，DNA解旋酶UvrD去除两切口之间的DNA片段，由DNA聚合酶和连接酶填补缺口。34. 简述人类核苷酸切除修复机制。答：人XPC蛋白负责发现DNA双螺旋中的变形，其功能相当于Ecoli中的UvrA；人XPB和XPD蛋白具

23、有解旋酶活性，其功能相当于Ecoli中的UvrB；核酸酶ERCCl-XPF切割损伤部位5侧，XPG切割3侧，其功能相当于uvrC高等生物NER切割单链DNA片段程度为2432个核苷酸。这一片段被释放后，产生的缺口由DNA聚合酶和连接酶填补。NER不仅能够修复整个基因组的损伤，而且能够拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即转录偶联修复。在这一过程中，NER蛋白被募集于暂停的RNA聚合酶。35. 简述人全基因组与转录偶联核苷酸切除修复过程中的异同点。答：人全基因组与转录偶联核苷酸切除修复的基本过程相同，即都有发现错误，解链并募集内切核酸酶，切割损伤部位，解旋去除损伤位点，DNA聚合酶和连

24、接酶填补缺口。转录偶联与全基因组核苷酸切除修复的不同点在于hER蛋白被募集于暂停的RNA聚合酶，并且转录偶联修复的核心TFH分别参与了两个独立过程：一是在核苷酸切除修复时起DNA解旋酶的作用；二是在转录过程中打开DNA模板。36. 简述大肠埃希菌重组修复机制。答：E-coli的rec基因编码的几种酶(recA、recB、reeC和recD)参与重组修复。recB、recC、recD酶复合物兼有解旋酶和核酸酶活性，它利用ATP水解提供能量沿着DNA移动。其中，recB和recD是两种解旋酶，recB沿DNA链5端解旋，运动速度较慢；而recD沿DNA链3端解旋，运动速度较快，导致单链DNA环状结

25、构逐渐累积。当recB、reeC、recD遇到chi序列。5-GCTGGTCC-3时，它就在附近将单链DNA切断，从而使DNA重组成为可能。Ecoli的recA蛋白在DNA重组中起关键作用。recA蛋白紧紧结合于单链DNA，每圈结合六个recA分子。DNA单链区产生于recB、recC、recD酶的作用或DNA缺口。recA蛋白结合DNA具有正协同效应。Ecoli的RuvA蛋白识别Holliday结构连接处，而RuvB蛋白具有解旋酶和ATPase活性，能驱动分支移动。最后由内切核酸酶RuvC特异识别Holliday结构中的ATrG序列并切割DNA，使Holliday结构分离，从而完成DNA重组

26、。37. 人DNA双链断裂后的修复机制。答：对于DNA双链断裂损伤，细胞必须利用双链断裂修复，即重缉修复，重组修复分为同源重组和非同源末端连接。DNA双链断裂后，细胞中存在姐妹染色体时，则通过同源重组的方式进行修复，如细胞中不存在姐妹染色体时，则通过非同源末端连接的方式进行修复。38. 简述SOS修复机制。答：在DNA受到严重损伤时，SOS应答能够诱导合成很多参与DNA损伤修复的酶和蛋白质。SOS应答十分迅速，在DNA损伤发生后几分钟内就可出现。转录阻遏蛋白LexA抑制若干编码参与SOS应答蛋白质的基因表达，具有潜在的蛋白水解酶活性，E coli的DNA损伤产生的单链DNA诱导recA蛋白水平

27、提高近50倍，而recA蛋白能激活LexA自我蛋白酶解，导致至少15个参与SOS应答的损伤修复蛋白基因解除阻遏状态而表达。recA激活的靶蛋白断裂位点是位于多肽链中央的二肽Ala-Gly。Ecoli的recA蛋白有双重功能，一是在DNA重组过程中具有DNA链交换活性；二是具有蛋白水解酶激活活性。当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除或重组修复，这时在内切核酸酶、外切核酸酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套特殊DNA聚合酶即SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核替酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。这种修复带给细胞很高的突

28、变率。39. 简述Sanger DNA测序法的原理。答：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3羟基末端，因此会终止聚合反应的进行a如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。40. 何谓PCR?试述PCR技术的基本原理和影响茵素。答：PCR是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，其原理类似DNA的体内扩增a它包括：PCR包括三个基本过程：变性，即在较高温度(9398)使双链模板

29、DNA变性解链成单链DNA，以提供复制的模板；退火，即在较低温度(3765)使加入的引物与待扩增DNA区域特异性地结合，以提供DNA复制起始的3-OH；延伸，即在适当的温度(70qC75)下，DNA聚合酶从特异性结合到DNA模板上的引物3一OH端开始，根据碱基互补配对原则，按照待扩增区域的核苷酸序列， 进行DNA链的延伸，即合成新的DNA分子。这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下个周期的模板，如此循环往复，经过11轮循环后，靶DNA的拷贝数理论n2=上呈2增长。影响PCR反应的因素主要有：引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板和Mg离子，此外，pH、温度、循环次数也会影

30、响PCR反应。41. PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 答：PCR是根据DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。用PCR扩增某一基因至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。42. 切口平移(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?答：(1)DNase I造成切口；(2)DNA聚合酶的5-3外切核酸酶进行切割；(3)DNA聚合酶的5-3合成酶进行修补；(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。43. 什么是Western免疫印迹?它与Southern印迹有什么不同?

31、答：Western免疫印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它Southern的不同在于探针的性质不同，在Western免疫印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。44. 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA?答：随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序(46=4096)；或是用DNase处理、牛胸腺DNA后获得的6-12个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在ICdenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底物中有放射性的dNTP时，新合成

32、的DNA就带上了标记。45. 什么是印迹(blotting)杂交?答：通过一定的物理学方法将DNA、RNA或蛋白质从凝胶上转移到固体支持物，然后同液体中的探针(抗体)进行杂交，以检测特异DNA、RNA或蛋白质的一种方法。因为DNA、RNA或蛋白质从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故此将这种杂交称为印迹杂交。46. 什么是原位菌落杂交(colony，hybridization)?答：原位菌落杂交是根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上，然后用放射性标记的探针同固定了的D

33、NA进行杂交经放射自显影后，确定哪一个菌落含有重组的DNA分子，再从参比平板上选取重组体。47. 简述Southem印迹杂交的原理和方法。答：Southern印迹杂交是1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相一液相杂交。该法的主要特点是利用毛细现象将DNA转移到固体支持物上，称为Southern转移或Southern印迹(Southern blot)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面，在通过和探针杂交来检测固体支持物表面的DNA。48. South

34、ern印迹杂交、Northern印迹杂交及Western免疫印迹彼此之间有哪些不同? 答：(1)检测目标物质不同：Southern印迹杂交检测的是DNA，Northern印迹杂交检测的是RNA，Western免疫印迹杂交检测的是蛋白质。(2)所用凝胶不同：Southern印迹杂交和Northern印迹杂交用的是琼脂糖凝胶，而Western免疫印迹用的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶。(3)是否变性电泳不同：Southern印迹杂交是跑非变性琼脂糖凝胶电泳，电泳之后在凝胶上用NaOH处理使DNA变性，然后转印；Northern印迹杂交实在电泳上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH

35、，因为它会水解RNA的2OH；Western免疫印迹则是跑变性的聚丙烯酰胺电泳或非变性的聚丙烯酰胺电泳。(4)探针不同：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交的探针是单链的DNA或RNA，而Western免疫印迹用的探针是特异性抗体蛋白质，而非核酸。49. Taq DNA聚合酶有哪些特性?答：Taq DNA聚合酶特性具有以下特性：(1)较高的热稳定性；(2)53聚合酶活性；(3)53外切酶活性；(4)具有转录酶活性；(5)较弱的非模板依赖性；(6)缺乏35外切酶活性。50. 如何提高PCR DNA聚合酶的保真性? 答：(1)使用Taq DNA聚合酶时，掺人少量具有35外切酶活性的耐

36、热DNA聚合酶，错配率可降为原来的110；(2)使四种dNTP底物浓度相等；(3)MgCl2浓度尽可能低；(4)减少循环数。51. PCR引物设计的原则主要有哪些? 答：(1)引物长度：1030 Nt；(2)碱基分布：A、T、G、C随机分布；(3)G+c含量：4060Tm=4(G+C)+2(A+T)；(4)引物之间：避免3端互补：(5)引物自身：不应形成二级结构；(6)引物3末端碱基：最好选T、c、G，不选 A；(7)引物5末端碱基：可不与模板DNA互补。52. 影响PCR扩增平台期的因素? (1)引物及dNTP底物浓度降低，掺入速度减慢。(2)酶与模板比例下降,底物过量。3）非特异性产物或引

37、物二聚体与反应物竞争4）产物的再结合53. 简述基因克隆的主要过程。答：制备目的基因和相关载体；将目的基因和有关载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达和其他研究54. 简述寡核苷酸介导的定点诱变技术的原理。答：利用Klenow片段(DNA聚合酶I大片段)延伸与单链环状DNA模板相配对的寡核苷酸引物，这个寡核苷酸引物除了有一处与模板的碱基错配外，其余部分均与模板互补，由寡核苷酸的错配处诱发突变，并在体外新合成一个杂合双链DNA，用T4 DNA连接酶将新合成的杂合双链DNA连接成双链闭环DNA分子，将体外合成的杂合闭环双链DNA转化到Ecoli

38、细胞，由于环状DNA复制的特点，就会同时产生野生型与诱变型两种DNA分子，最后通过筛选，将诱变型DNA分子筛选出来。55. Klenow片段的主要用途有哪些 答：(1)补齐双链DNA的3末端。(2)通过补齐3端，标记3末端。(3)在cDNA克隆中，合成第二股链。(4)DNA序列分析。56. 末端脱氧核苷酸转移酶的作用。答；末端脱氧核苷酸转移酶能将脱氧核苷酸加到DNA的3，OH，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行克隆57. 将DNA分子进行体外连接的方法：黏性末端连接、平端连接、同聚物加尾连接、人工接头连接58. 表达融合蛋白有何优点 答：表达融合蛋白的优点如下

39、：(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解；(2)如果融合蛋白中有信号肽序列，可产生分泌型产物(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化59. 碱性磷酸酶在基因克隆中的作用。答：碱性磷酸酶能去除DNA或RNA 5端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身环化，提高重组效率。60. 基因克隆过程中，获得目的基因的途径有哪些? 答：(1)从基因组文库中获得 (2)从cDNA文库中获得 (3)PCR扩增特定基因61. 什么是基因突变?它有哪些主要类型? 在特定DNA序列中，碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变，导致DNA一级结构变化，称为基因突变。主要类型分为

40、：1)点突变，在DNA序列某个位点上，一种碱基(核苷酸)被另一种取代所产生的改变 2)缺失，一个碱基或一段碱基序列丢失的改变。3)插人，某个位置增加一个碱基或一段碱基序列的改变4)重排，常见有反置或迁移倒位，即基因DNA序列内部重组5)配子突变和体细胞突变；6)动态突变，微卫星序列串联重复拷贝数随着世代传递而不断增加的现象62. 简述基因突变的不同遗传学效应。 基因突变的遗传学效应包括错义突变、无义突变、同义突变和移码突变。1)错义突变 是因DNA分子中碱基对被取代，突变基因中相应密码子所编码氨基酸被另一种所取代。2)无义突变 是由于碱基取代、缺失或插入后使得编码某种氨基酸的密码子变成了终止密

41、码子，导致蛋白质翻译过程被提前终止。3)同义突变 是由于遗传密码的简并性，使突变前后相应密码子编码同一氨基酸。4)移码突变 是指DNA序列中发生单碱基，多个碱基或DNA片段的缺失或插入，导致突变点后三联密码阅读框改变。63. 何谓基因诊断?与传统医学诊断相比，它具有哪些特点?答：用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法。具有高特异性、高灵敏性、早期诊断性、应用的广泛性等特点。64. 简述SSCP分析的原理。答：在非变性条件下，DNA分子为维持其稳定而自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这

42、种构象是由单链DNA分子中的碱基顺序所决定，DNA分子中的碱基变异(即使只有一个碱基)可导致其空间构型的改变，形成不同的构象，导致电泳迁移率发生改变。65. 单核苷酸多态性用作遗传标志具有那些突出优势 答：分布更广泛；高度稳定性；部分位于基因内部，直接影响基因功能发挥；是双等位基因型的，易于自动化分析。66. 简述DNA指纹分析的基本流程。答：DNA指纹分析的基本流程为：DNA的提纯与纯化限制性内切酶消化一电泳分离_分子杂交-+指纹图的显示。67. 简述基因诊断在传染病检测中的应用。答：任何类型的病原体，包括病毒、支原体、细菌、真菌和寄生虫，它们感染宿主细胞后均携带有自身特异的遗传信息DNA影

43、或RNA，它们侵入机体后引起的传染病和寄生虫病等，都可以用基因诊断技术来进行检测或诊断。68. 试述内源基因结构突变的主要类型以及内源基因结构突变所致的疾病。答：内源基因结构突变包括点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因重排、基因扩增等。突变若发生在生殖细胞，可引起各种遗传性疾病；若发生在他细胞，可导致肿瘤、心血管疾病等69. 荧光原位杂交的特点及应用包括哪些?答：(1)其探针比放射性探针更稳定，不需要特殊的安全防护和污物处理措施；(2)与原位杂交一样，不需要提取和纯化核酸；(3)多色TLSI-I可以在同一核中显示不同的颜色，从而同时检测两种或多种序列；(4)应用不同的探针可以显示某一物种的

44、全部基因或某一染色体、染色体片段及单拷贝序列。70. 简述自杀基因治疗的原理。答：将“自杀基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。71. 简述eX vivo和in vivo两种基因治疗途径。答：根据基因转移的途径不同，基因治疗分为：(经活体)是指在体外将目的基因导人靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。in vivo(活体内)是指将目的基因直接应用于患者体内。72. 简述RNA干扰的作用机制。答 RNA干扰包括起

45、始阶段和效应阶段。在起始阶段，加人的小分子RNA被切割为2123核苷酸长的小分子干扰RNA片段。证据表明一个称为Dicer的酶，是lase家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，将其切割将DNA降解为1921bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源转录的mRNA，并在距离siRNA 3端12个碱基的位置切割

46、mRNA。73. 治疗基因的受控表达策略有哪些?答：治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。74. 列举肿瘤基因治疗的常用方法。答：通过基因置换和基因添加，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；抑制癌基因的活性，通过于扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；通过导入“自杀基因杀伤癌细胞。75. 简述基因治疗的几种策略。答：(1)基因置换。(2)基因添加。(3)基因干预。(4)自杀基因治疗。5）基因免疫治疗