大肠杆菌感受态

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工 构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一 个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体 细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化(Transformatio n)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性 状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技 术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M，它可以容忍外源DNA分子进入体内并

2、稳定 地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaC12 ,RbCl(KCl )等化学试 剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子 进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达 实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛 选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体 细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法 制备的感受态细胞转化效率较高 ,但 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可

3、以 满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15的 无菌甘油于-70C保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS 法制备感受态。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从 -70C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生 长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制DH5a 菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5x107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同), 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的

4、质量和浓度： 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cDNA)。转化效率与夕卜源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外 源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低lng的cDNA即可使50卩1的 感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5。3. 试剂的质量：所用的试剂均需是最高纯度的（GR或AR.）,并用超纯水配制, 最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用 器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且 注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA

5、所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用TSS缓冲液处理,使其处于感受 态,然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因 （Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含 Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定 已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一 步鉴定。一. 材料E. coli DH5a 菌株二. 设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱

6、， 恒温水 浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。三. 准备工作LB固体培养基、LB液体培养基、1.5ml离心管、牙签、1ml枪头、200ultip 50ml 离心管、空三角瓶、一包平皿等；注：以上物品试剂高压灭菌备用，最好现用现备比较好，避免感受态被污 染。四. 试剂1.LB 固体和液体培养基100ml1% Tryptone （胰化蛋白胨）1g0.5% yeast EXtrat （酵母提取物）0.5g1%Nacl1g1.5% Agarose（LB 固体培养基）11.5g2.Amp母液：抗生素，一般实验室配制的amp浓度为100ng/u 1,按照1000:1的 比例加入到LB培养基中（注：

7、100mlLB中加入100 ul的amp抗生 素）。3. 含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/m 1,摇匀后铺板。4. 缓冲液1XTSS的配制TSS10%PEG3350 5%DMSO 20mm MgSO4液体 LB100ml10g5g2ml（1M MgSO4）98ml注：事先配制1M的氯化镁20.3g氯化镁（6分子水结晶）/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的 100ml 量筒和 100ml 烧杯，用量筒量取 98m1LB，加入至烧杯中，取 10 g PEG（MW= 3350）, 5ml DMSO, 2

8、ml 的 1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22pm 滤器过滤除菌。储存在-20度，保质期约6个月。TSS 方法制备感受态细菌（又称一步法）五：制备步骤1、划线在感受态制备前一天夜晚划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养菌种Dh5a；2、 小样摇菌挑取5-6个单克隆菌斑接种到1ml无抗液体LB中，置于37度恒温振荡培养箱中振荡培养，一般培养6-8h（小样摇菌）。.3、 大样摇菌按照1:100的比例将小样培养的菌液（500卩1）加入到新的无抗的液体 LB 培养基中，置于 37 度恒温振荡培养箱中振荡培养，一般培养3-4h（大样摇菌）振荡培养至O

9、D6oo为0.40.5即可。4、将准备好的菌液冰浴30min后，分装到50ml离心管中，4C、4000rmp离心 10min,弃上清收集菌体，加入原体积1/10 （5ml）的lxTSS缓冲液（缓冲 液在冰上预冷30min）悬浮细胞，分装成100卩1/1份在1.5ml离心管中，全 部过程冰上操作，分装完成的感受态-80C保存，一旦从超低温冰箱取出的 感受态不能重新放回，反复冻融会影响转化效率。（ 50ml 离心管、 1.5ml 离心管提前放在-20 C冰箱预冷）六、转化时取一管（100卩1）感受态细菌，（感受态细胞应置于冰上缓慢融化后 立即使用）加入20卩1 KCM （5M KCM），加入70卩

10、1 ddH2O，加入3-5卩1连 接产物（DNA、0.1100ng），轻轻混匀后冰浴30min, 37C水浴热激5min， 立即置于冰上。加入0.2ml含20mmol/L液体LB培养基，37度150r/min 温和振荡培养60-90min，枪取100卩1菌液于AMP抗性的LB平板上，涂 布均匀，待平板上菌液吹干后，放于 37 度恒温培养箱过夜培养四、 计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌 落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积/涂板菌液体 积转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA 加入量（mg）感受态细胞总数=对照组2菌落数x稀释倍数x菌液总体积/涂板菌 液体积感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数注意 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液 进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板 ,而有的转化效率低,涂板时必须 将菌液浓缩（如离心）,才能较准确的计算转化率。