大肠杆菌PCR检测方法

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1、ICS 11.220DB21B41辽 宁 省 地 方 标 准DB21/ XXXXXXXXX大肠杆菌PCR检测方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX 实施XXXX - XX - XX 发布辽 宁省 质量技 术监督局 发 布本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院 本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清

2、竹，陈瑶大肠杆菌PCR检测方法1 范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌 的检测。本标准中的试验操作应在生物安全II级(BSL-2)以上的实验室进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。E.col i： 大肠杆菌(Escherichia coli)DNA:脱氧

3、核糖核酸(Diethylpyrocarbonate)bp：碱基对(base pair)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate)Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)TAE :三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液(Tris ace tat e-EDTA buffer)4 原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延 伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的

4、子链DNA。5 仪器和器材本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机(最大离心力12 OOOg以上)、冰箱、 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器 和吸头等。6 试剂和材料6.1 DNAzol Reagent： DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于48C保存。6.2 无水乙醇：-20C预冷。6.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20C预冷。6.4 DNA 聚合酶：Ex Taq DNA 聚合酶（5 U/uL）。6.5 dNTP（2.5 mmol/L）。6.6引物：引物浓度为20umol/L；上游引物序列为5 - G

5、CCTCGCCTGGAGAATGA-3,下游引物 序列为 5 -CCTGAGACTGCGGTGGAA-3。6.7 阴性对照：灭菌双蒸水6.8 阳性对照：E.coli ATCC25922。6.9 无菌生理盐水。6.10 TAE： Tris-乙酸电泳缓冲液，6.11 溴化乙锭。6.12 DL2000 DNA Marker。注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容 器分装。7 操作步骤7.1 样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2 采样工具药匙、15 mL离心管和1.5 mL

6、离心管经121 （士2）C均高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 C干热 灭菌2 h。7.1.3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。 称取1 g病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清 液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.4 内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15 mL灭菌离心管中，按1： 5倍体积加入无菌生理盐 水，混匀，3000 rpm离心20min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.5 粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发

7、病猪新鲜粪便，装入15 mL灭菌离心管中，按1： 5倍体积加入无菌生理盐 水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.6 血液无菌采集心血，按1： 1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入 1.5 mL灭菌离心管中编号备 用。7.1.7 大肠杆菌纯培养物挑取37C 1824h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转 入1.5 mL灭菌离心管中编号备用，待检。7.1.8 保存与运输采集或处理的样品在28C条件下保存应不超过24h ；若需长期保存，应放置-70C冰箱，但应 避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用

8、保温壶或保温桶加冰密封，在68 h之 内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2 PCR检测 7.2.1 DNA 提取7.2.1.1取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离 心管进行编号。7.2.1.2每管加入800 uLDNAzol,分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200 uL，颠倒混匀后， 4 C 12000 g 离心 10 min。7.2.1.3取与7.2.1. 1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，吸取900 uL上清液转移至相应的管 中，加入500 u L无水乙醇混匀后。7.2.1.4 4C

9、12000 g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL 75%乙醇，洗涤。7.2.1.5 4 C 12000 g离心5 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗 2次。7.2.1.6 4000 g离心10 s,用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥310 min。7.2.1.7加入20 UL经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70 C冰箱。7.2.2 PCR7.2.2.1 PCR反应体系建立25uL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中:灭菌蒸馏水17.375uL10 X PCR Buffer2.5uL2.5mM dN

10、TP2uLEx Taq DNA 聚合酶0.125uL上游特异性PCR引物0.5uL下游特异性PCR引物0.5uLDNA2uL7.2.2.2 PCR反应条件94 C预变性5 min； 94 C变性45 s，56 C退火45 s，72 C延伸50 s，35个循环；72 C 终延伸10 min7.2.2.3 电泳将PCR扩增产物6uL与lu L上样缓冲液混合，点样于1 %琼脂糖凝胶（含0.5卩g/mL溴化乙锭） 孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker （分子质量标准物），缓冲液为1XTAE, 以5 V/cm电压电泳25min。8 结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对

11、照出现在272 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现272 bp扩增条带为E.coli核酸阳性，未出现272bp 扩增条带的样品判为 E.coli 核酸阴性。附录A（规范性附录）试剂配制A.1 电泳缓冲液（50倍）A.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 灭菌双蒸水 氢氧化钠灭菌双蒸水A.1.2 TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50倍）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯） 冰乙酸0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8. 0） 灭菌双蒸水用时用灭菌双蒸水稀释使用。18.61 g80 mL调pH至8. 0 加至100 mL242 g57.1 mL100 mL 加至1000 mLA.2 1%琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）TAE电泳缓冲液（50倍）灭菌双蒸水微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液101g2 mL98 mL u L。