第十八章支原体衣原体立克次体

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1、 第十八章支原体、衣原体、立克次体 第一节支原体n是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。为支原体。支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染

2、细胞培养，给除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。来一定困难。一、肺炎支原体一、肺炎支原体n感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借滑借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。蛋白。n是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎现为上呼吸道感染综合征，占非细菌性肺炎的的1 13 3以上。过

3、去认为是温和的病原体，现以上。过去认为是温和的病原体，现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。性溶血性贫血、肾炎等。微生物特性微生物特性1形态与结构形态与结构 类似酒瓶状，没有细胞壁，类似酒瓶状，没有细胞壁，仅有细胞膜。仅有细胞膜。G-易着色，易着色，Giemsa染色呈淡染色呈淡紫色。细胞膜中胆固醇含量多。所有肺炎紫色。细胞膜中胆固醇含量多。所有肺炎2株共同具有株共同具有P1蛋白，是主要特异性免疫蛋白，是主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原。原和血清学诊断的

4、主要抗原。2.抗原结构抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，常用生长抑制试验常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验与代谢抑制试验 (MIT)鉴定。鉴定。GIT是将吸有型特异性抗血清是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象。象。MIT是将支原体接种在含有抗血清培养是将支原体接种在含有抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法

5、可将原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法可将 支原体分成若干血清型。支原体分成若干血清型。3 3培养特性培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋荷包蛋”状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。4 4生化反应生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别。体进行鉴别。5.5.抵抗力抵抗力1.1.对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，-70-70或液氮可长期冻

6、存或液氮可长期冻存,4,4放置也不放置也不 要超过要超过3 3天。天。2.2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。检验程序检验程序1.标本采集标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。2.PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实法快速、敏感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体检测肺炎支原体DNA。3.电子显微镜观察无细胞

7、壁，易与细菌鉴别。电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。4.分离培养分离培养n以牛心消化液为基础以牛心消化液为基础,加加2020小牛血清及新小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入青霉素青霉素,可防止杂菌生长。初次分离生长缓可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含慢，在含5 5C02C02下培养，下培养，1010天长出油煎蛋状天长出油煎蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大对临床诊断意义不大,但对流行病学调查有

8、但对流行病学调查有重要意义重要意义 。5抗体检测抗体检测(1)ELISA：此法敏感，特异性高，快速、此法敏感，特异性高，快速、经济，并可检测经济，并可检测IgM和和IgG抗体，为目前抗体，为目前诊断的可靠方法。检测分子量诊断的可靠方法。检测分子量190kDa的的P1蛋白，蛋白，3h可完成试验，特异性高，敏可完成试验，特异性高，敏感性为感性为10 4CFUl标本。标本。(2)(2)补体结合补体结合(CF)(CF)试验试验n试验所用的抗原为氯仿试验所用的抗原为氯仿甲醇提取的糖脂甲醇提取的糖脂类抗原。类抗原。n双份血清试验，效价呈双份血清试验，效价呈4 4倍增长者，或单倍增长者，或单份血清效价份血清

9、效价ll：128128者，者，8080的病例表的病例表明近期有肺炎支原体感染。明近期有肺炎支原体感染。(3)(3)间接血凝试验间接血凝试验n操作简便，敏感度略高于补体结合试验，操作简便，敏感度略高于补体结合试验，感染发病后感染发病后7 7天出阳性，天出阳性，10-3010-30天达高峰，天达高峰，12-2612-26周逐渐降低。周逐渐降低。n本试验与补体结合试验类似，主要测本试验与补体结合试验类似，主要测lgMlgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应。应。(4)(4)冷凝集试验冷凝集试验 是一种非特异性试验。其方法是将患者血是一种非特异性试验。其方法是将

10、患者血清与清与O型型Rh阴性红细胞在阴性红细胞在4 下作凝集试下作凝集试验。有验。有3376肺炎支原体感染者为阳肺炎支原体感染者为阳性性(效价效价1：64)。效价越高或双份血清呈。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大。性越大。二、解脲脲原体二、解脲脲原体n也称溶脲脲原体，是也称溶脲脲原体，是1954年年Shepard首先首先从非淋菌性尿道炎从非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分患者的尿道分泌物中分离获得，因其分解尿素的特性泌物中分离获得，因其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。在分类学上属人支命名为解脲脲原体。在分类学上属人支原体科脲

11、原体属。是人类泌尿生殖道最原体科脲原体属。是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，近年来研究发现，常见的寄生菌之一，近年来研究发现，它与多种疾病有关，故引起国内外有关它与多种疾病有关，故引起国内外有关学者的广泛重视。学者的广泛重视。1.寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附婴传播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产生生IgA蛋白酶，破坏蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，的局部抗感染作用，有利

12、于粘附和致病。有利于粘附和致病。2.引起非淋菌性尿道炎引起非淋菌性尿道炎(NGU)，上行感染，上行感染，可引起前列腺炎或附睾炎；阴道炎和宫颈可引起前列腺炎或附睾炎；阴道炎和宫颈炎，并可导致流产。因为与人精子膜有共炎，并可导致流产。因为与人精子膜有共同抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。同抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。微生物特性微生物特性1形态结构形态结构 在液体培养基中以球形为主，在液体培养基中以球形为主，直径约直径约50-300nm，单个或呈双排列，能通，单个或呈双排列，能通过微孔滤膜；过微孔滤膜；G-但不易着色，姬姆萨染色但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层膜构呈紫

13、蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层膜构成。内、外两层由蛋白质组成，中层为类成。内、外两层由蛋白质组成，中层为类脂质，胞内含核糖体和双股脂质，胞内含核糖体和双股DNA。DNA中中十十C含量为含量为269298mol。2 2培养特性培养特性n营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母，常营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液。用的基础培养基为牛心消化液。37生长良生长良好，好，22生长差，生长差，42不生长，最适不生长，最适pH为为55-65。在含。在含95N2和和5C02气体环境气体环境下培养下培养2天形成很小菌落，呈天形成很小菌落，呈“荷包蛋荷包蛋”样，样，放大放大200倍才能观察

14、到，故称倍才能观察到，故称T株。生长除胆株。生长除胆固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素产氨，固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素产氨，不分解葡萄糖和精氨酸。不分解葡萄糖和精氨酸。3.3.抗原构造抗原构造n有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清个血清型划分为型划分为A、B两大群，其中以两大群，其中以4型引起疾病型引起疾病频率高。频率高。A群各型均含有群各型均含有16kD和和17kD多肽；多肽；B群各型仅含群各型仅含17kD多肽；而多肽；而13血清型只含有血清型只含有16kD多肽，以能识别多肽，以能识别16kD和和17kD多肽的单多肽的单抗，为区别血清群特异性标志。抗

15、，为区别血清群特异性标志。4 4抵抗力抵抗力n由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解。对热抵抗力差。在和补体溶解。对热抵抗力差。在4存活约存活约2周左右，周左右，70中可存活中可存活 2-3年。年。n对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链

16、霉素、丁胺卡那霉素等敏感。胺卡那霉素等敏感。微生物检验微生物检验 1标本采集标本采集 用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育症患者的精液，阴道炎与宫颈因不明的不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿标炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿标本以无菌方法取本以无菌方法取10ml，离心沉渣作接种物。，离心沉渣作接种物。2 2标本直接检查标本直接检查(1)核酸检测核酸检测n16个血清型均有个血清型均有460bp的的DNA片段。通过对片段。通过对PCR产

17、物的核酸杂交和序列分析，可将各产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。鉴于本法敏感性高、种支原体鉴别分类。鉴于本法敏感性高、稳定可靠、快速简便，将成为临床快速诊稳定可靠、快速简便，将成为临床快速诊断的重要实验手段。断的重要实验手段。nDNA探针技术法敏感，可测出探针技术法敏感，可测出50100pg的的DNA。(2)ELISA 可测定血清型别，还可测出可测定血清型别，还可测出Ig的类型的类型(IgM、IgG)，较敏感、特异性强，有诊，较敏感、特异性强，有诊断意义。断意义。(3)免疫斑点试验免疫斑点试验(IDT)检测抗原提取物和培养物。此法敏感，检测抗原提取物和培养物。此法敏感，特异性，

18、不需特殊仪器，易于推广，可特异性，不需特殊仪器，易于推广，可作为临床感染者病原检查的特异诊断方作为临床感染者病原检查的特异诊断方法。法。3 3分离与鉴定分离与鉴定n取标本取标本O102ml接种于接种于pH60含有酚红含有酚红和尿素的液体培养和尿素的液体培养37孵育，颜色由黄变红孵育，颜色由黄变红者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、脂培养基中有尿素、005molHEPES缓冲液缓冲液和和MgS04，菌落呈黑褐色易辨认，菌落呈黑褐色易辨认，95N25C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态。镜观察

19、菌落形态。n经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特异抗血清作特异抗血清作MIT和和GIT作进一步鉴定。作进一步鉴定。三、穿通支原体三、穿通支原体 n能粘附、穿入淋巴细胞和单核吞噬细胞中能粘附、穿入淋巴细胞和单核吞噬细胞中大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。能大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。能促进促进HIVHIV的复制和病程的发展，是艾滋病的复制和病程的发展，是艾滋病的辅助致病因素。的辅助致病因素。n为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，菌落呈荷包蛋样

20、，生长较慢，初代多在菌落呈荷包蛋样，生长较慢，初代多在1010天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。或沉淀。n对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对青霉素不敏感。青霉素不敏感。微生物检验微生物检验1标本采集标本采集 取材对象是取材对象是AIDS患者或患者或HIV 感染者。用咽拭子。感染者。用咽拭子。2选选SP-4培养基分离培养，培养基分离培养，37温箱培养，温箱培养，每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，

21、视无沉淀，视“培养可疑阳性培养可疑阳性”，再用滤膜，再用滤膜过过 滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为红变黄，则认为“初代培养阳性初代培养阳性”。3.3.鉴定鉴定 生化反应生化反应 (1)培养物接种于含培养物接种于含1葡萄糖的葡萄糖的SP-4培养基培养基 (发酵葡萄糖试验发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基，若能分解它，培养基 颜色由红变黄。颜色由红变黄。(2)培养物接种于含有精氨殿培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖不含葡萄糖)的的SP-4培养基培养基(水解精氨酸试验水解精氨酸试验)中，若中，若 能水解它，能水解它，pH上升。上升。(3)培养

22、物接种于仅含尿素的培养物接种于仅含尿素的SP-4培养基培养基(分分 解尿素试验解尿素试验)中，观察中，观察 pH变化。变化。代谢抑制试验代谢抑制试验(MIT)n取取104CFUml阳性培养物分别加入阳性培养物分别加入2支含支含3ml改良的改良的SP-4培养基中，其中培养基中，其中1支加入适支加入适量抗量抗Mpe标准血清作为试验管，另标准血清作为试验管，另1支不加支不加抗血清作为对照管，抗血清作为对照管，37培养。培养。n试验管颜色不变试验管颜色不变(生长被抑制生长被抑制)，对照管颜色，对照管颜色由红变黄由红变黄(支原体生长支原体生长)。生长被杭血清抑制。生长被杭血清抑制的管为的管为MIT阳性，

23、该培养物则为阳性，该培养物则为Mpe，根，根据抗血清的型别进行据抗血清的型别进行Mpe分型分型。PCR 用用Mpe套式套式PCR(nPCR)，靶基因为，靶基因为Mpe的的16SrRNA基因特异性片段。基因特异性片段。Mpe-nPCR最最终扩增长度为终扩增长度为410bp，按试剂盒说明书操，按试剂盒说明书操作，能扩增出特异性作，能扩增出特异性MpeDNA，认为此法，认为此法更灵敏、特异、快速的更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。检测方法。抗体检测抗体检测n国外学者在国外学者在HIV感染者中用感染者中用ELISA法检测法检测出大量出大量Mpe抗体，其中无症状者的阳性率抗体，其中无症状者的阳性率为为

24、20，有艾滋病者为，有艾滋病者为40，阴性对照，阴性对照0.3。第二节 衣 原 体 n是一类专性细胞内寄生、有独特发育周是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。归属于广义的细菌范畴。物。归属于广义的细菌范畴。n衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。一、沙眼衣原体一、沙眼衣原体n不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。n

25、近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。学界的重视。n沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等）和鼠生物变种等3个生个生物变种。物变种。1沙眼亚种沙眼亚种(1)沙眼：沙眼：通过眼通过眼-手手-眼途径直接或间接密切接触传眼途径直接或间接密切接触传 播。由播。由A、B、Ba和和C血清型引起。结膜引血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜

26、血管翳，影响视力。及角膜血管翳，影响视力。(2)(2)包涵体结膜炎：包涵体结膜炎：由由B B、BaBa、D D、DaDa等血清型引起。婴儿通过等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角 膜血管翳。膜血管翳。(3)(3)泌尿生殖道感染：泌尿生殖道感染：由由D-KD-K血清型引起。在性接触传播引起的血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（非淋菌性泌尿生殖道感染（50506060）。）。易发展为持续感染或无症状携带者。易发展为持续感染或无症状携带者。2.2.性病淋巴肉芽肿亚种，由性病淋巴肉芽肿亚种，由L L血清型引起血清型引起性病

27、淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。3.3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关。鼠肺炎有关。微生物特性微生物特性1发育周期与形态染色发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发衣原体具有特殊的发育周期。育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核有胞壁和拟核,是发育成熟的衣原体，具有高是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；大形成网状体；网状体或称

28、始体，圆形，网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需再感染其他细胞，每个发育周期约需4872h。抗原结构抗原结构复杂，有属、种、型等特异性抗原。复杂，有属、种、型等特异性抗原。(1)属特异性抗原：为胞壁属特异性抗原：为胞壁LPS，属特异性补，属特异性补 体结合抗原，应用于血清学诊断。体结合抗原，应用于血清学诊断。(2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白种特异性抗原：位于主要外膜蛋白 （MOMP）上，可用补体结合试验和中和）上，可用补

29、体结合试验和中和 试验检测。试验检测。(3)型特异性抗原：也位于型特异性抗原：也位于MOMP上，用单上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的体的18个型别。个型别。培养特性培养特性n沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用68d龄龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培养养4872h后可在细胞内查到包涵体及原体后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒。和始体颗粒。n近年多采用细胞培养衣原体，常用的细胞近年多采用细胞培养衣原体，常用的细胞株为株为Hela-299和和McCoy。抵抗力抵抗力n沙眼衣

30、原体感染材料在沙眼衣原体感染材料在37条件下，经条件下，经48h左右即失去活力，左右即失去活力，566 min灭活。灭活。-70可保存数年，冷冻干燥可保存可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍年以上仍有活性。有活性。O.1甲醛或甲醛或O.5石炭酸溶液石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，杀死沙眼衣原体，2来苏仅需来苏仅需5min。n红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。原体有抑制作用。沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。性病淋巴肉芽性病淋巴肉芽肿：采淋巴结脓汁，也可取

31、直肠拭子或活检肿：采淋巴结脓汁，也可取直肠拭子或活检材料送检。材料送检。用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。免疫学方法免疫学方法1)免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。标记抗衣原体内衣原体抗原。标记抗衣原体LPS抗体，抗体，可与所有衣原体反应；而抗可与所有衣原体反应；而抗MOMP抗体有抗体有种、型特异性。可在种、型特异性。可在1h内即作出诊断并可内即作出诊断并可分

32、型。分型。2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。核酸检测核酸检测1)核酸杂交：用核酸杂交：用125I标记的衣原体标记的衣原体rDNA探针检探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比分别为分别为82.8和和99.4。2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体眼衣原体75kb质粒、质粒、MOMP序列及序列及16SrRNA基因序列设计引物。基因序列设计引物。分离培养分离培养n将标本拭子，用含抗生素的稀释液

33、制成将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10-20悬液。分离的细胞有悬液。分离的细胞有McCoy、HeLa-229细胞等。置细胞等。置5CO2下培养。下培养。n初代分离培养初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状后传代或盲传。有症状病人病人90标本第标本第1代即可见包涵体，而无症代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。状病人需传代后才得到阳性。n敏感性为敏感性为80-90，特异性，特异性100，是目前，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。法的标准。鸡胚培养鸡胚培养n有细菌污染的临床标本加适当的抗生素有细菌污染的临床标本加适当的抗

34、生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉肉汤，在室温中作用汤，在室温中作用lh后，接种后，接种3-4只孵只孵育育7天的鸡胚卵黄囊，天的鸡胚卵黄囊，35孵育，观察孵育，观察至至13天，收获卵黄囊涂片，作天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。染色，镜检原体。鉴定鉴定1.将细胞培养盖片用将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检或碘染色镜检胞质内包涵体。胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离

35、的材料可用免疫荧于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原光法鉴定原体或补体结合抗原。抗体检测抗体检测n目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小。值很小。n原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。因而限制了血清学方法的诊断价值。n方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验、微量免疫荧光试验(MIF)、酶免疫法等。其中、酶免疫法等。其中CF敏感性和

36、特异性较敏感性和特异性较差，而差，而MIF敏感性和特异性较高。敏感性和特异性较高。三、鹦鹉热衣原体三、鹦鹉热衣原体n鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体，主要引鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体，主要引起禽畜感染，也可由动物传染到人，引起起禽畜感染，也可由动物传染到人，引起肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。n也有衣原体独特的生活周期，包涵体较致也有衣原体独特的生活周期，包涵体较致密，形态不一，碘染色阴性，是与沙眼衣密，形态不一，碘染色阴性，是与沙眼衣原体鉴别要点原体鉴别要点(沙眼衣原体含糖原，碘染沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性色阳性)。抗原检测抗原检测1)免疫荧光检查

37、：以衣原体属、种或型的单免疫荧光检查：以衣原体属、种或型的单克隆抗体与荧光素结合后中衣原体抗原的克隆抗体与荧光素结合后中衣原体抗原的存在，用微量免疫荧光法还可用于衣原体存在，用微量免疫荧光法还可用于衣原体的分型。的分型。2)酶免疫法酶免疫法(EIA)检测：将衣原体单克隆抗检测：将衣原体单克隆抗体与酶结合，用于组织或细胞的染色，枪体与酶结合，用于组织或细胞的染色，枪测衣原体抗原。测衣原体抗原。E1A法比免疫荧光法准确法比免疫荧光法准确性略高，且可避免主观因素的影响。性略高，且可避免主观因素的影响。核酸检测核酸检测1)核酸探针检测法：将衣原体核酸探针检测法：将衣原体MOMP基因、基因、特异特异LP

38、S表位基因，及其他决定鹦鹉热衣原表位基因，及其他决定鹦鹉热衣原体抗原的基因片段做成探针，对衣原体体抗原的基因片段做成探针，对衣原体DNA进行斑点杂交或进行斑点杂交或Southern印迹杂交试印迹杂交试验，可准确灵敏测出鹦鹉热衣原体，也可用验，可准确灵敏测出鹦鹉热衣原体，也可用于种内株系的鉴别。于种内株系的鉴别。2)PCR：检测检测3种衣原体的种衣原体的MOMP基因序列是基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法。简便、微量、快速、敏感的检测力法。分离培养分离培养(1)鸡胚培养：鹦鹉热衣原体的分离常用鸡胚卵鸡胚培养：鹦鹉热衣原体的分离常用鸡胚卵 黄囊接种与传代，可取得满意效果。黄囊接种与传代，可

39、取得满意效果。(2)小鼠分离：选择腹腔接种、颅内接种和滴鼻小鼠分离：选择腹腔接种、颅内接种和滴鼻 接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠 和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘 性渗出物，全肺叶有实变。性渗出物，全肺叶有实变。(3)细胞培养：细胞培养常用细胞培养：细胞培养常用PL细胞、细胞、BHK细细 胞、胞、Vero细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。但直接用于临床标本的分离培养效果不好，但直接用于临床标本的分离培养效果不好，最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后

40、再细胞培 养容易成功。养容易成功。抗体检测抗体检测方法有补体结合试验方法有补体结合试验(CF)、间接血凝试验、间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试和酶联免疫吸附试(ELISA)等。等。补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿以及肺炎的试验。芽肿以及肺炎的试验。CF抗体效价呈抗体效价呈4倍增长倍增长者可作诊断。一次者可作诊断。一次CF抗体结果，需效价高于抗体结果，需效价高于1：64才可能作临床诊断。才可能作临床诊断。四、肺炎衣原体四、肺炎衣原体 n肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，是一种重要的呼吸道

41、病原有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。n还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系，越来越引起人们的注意。心病的关系，越来越引起人们的注意。微生物特性微生物特性1有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈 型的梨形，并有清晰的周浆间隙。型的梨形，并有清晰的周浆间隙。2全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙全

42、基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙 眼衣原体的眼衣原体的DNA同源性同源性10，而不同来，而不同来 擗擗TWAR株都具有株都具有94以上的以上的DNA同源性，同源性，其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体 与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。3用用HEp-2和和HL细胞系较易分离和传代。细胞系较易分离和传代。抗体检测抗体检测以微量免疫荧光试验以微量免疫荧光试验(MIF)最为敏感，该试验最为敏感，该试验阳性者阳性者5070可分离出可分离出 TWAR，用此法，用此法检测特异性的检测特异性的IgM和和IgG抗体，有利于区

43、别近抗体，有利于区别近期感染和既往感染，也有利于区别原发感染期感染和既往感染，也有利于区别原发感染和再感染，和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别的再感染相当常见，特别是老年人，再感染时一般不出现是老年人，再感染时一般不出现lgM和补体结和补体结合抗体。合抗体。第三节第三节 立克次体立克次体 对人致病的立克次体有五个属立克次体属、对人致病的立克次体有五个属立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。通体属。共同特点共同特点大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；疹性疾病；以节肢动物为传播媒介或为储存

44、宿主；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；除了少数外全是专性活细胞内寄生；除了少数外全是专性活细胞内寄生；菌体内同时含有菌体内同时含有DNADNA和和 RNARNA两类核酸；两类核酸；以二分裂方式进行繁殖；以二分裂方式进行繁殖；对抗生素敏感。对抗生素敏感。一、斑疹伤寒立克次体(一一)临床意义临床意义 1普氏立克次体是流行性斑疹伤寒普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传又称虱传 斑疹伤寒斑疹伤寒)的病原体。的病原体。病人是惟一的传染源，体虱是主要传

45、播媒病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，介，而非储存宿主。而非储存宿主。传播方式为虱传播方式为虱-人人-虱，体虱仅是传染媒介。虱，体虱仅是传染媒介。莫氏立克次体莫氏立克次体n地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒又称鼠型斑疹伤寒)的病原的病原体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱。蚤或鼠虱。n鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。在人群中传

46、播。致病物质致病物质n有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶；其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。主细胞并在其中生长。n普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。器官损伤。(二二)微生物特性微生物特性1.比细菌小，呈多形态性，在感染细

47、胞内聚比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团集成团,分布在胞质内分布在胞质内,Gimenez法染色后法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。呈红色，外表含有微荚膜结构。2.必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要需要C02。通常采用。通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊日龄鸡胚作卵黄囊接种，于接种，于32-35孵育孵育413d内死亡，鸡内死亡，鸡胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分

48、离。3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供辅助诊断。应，可供辅助诊断。外斐反应外斐反应 立克次体病立克次体病 变形杆菌变形杆菌 OX19OX19变形杆菌变形杆菌 OX2OX2变形杆菌变形杆菌 OXkOXk流行性斑疹伤寒流行性斑疹伤寒+-地方性斑疹伤寒地方性斑疹伤寒+-

49、斑点热斑点热+/+/+/+/+-恙虫病恙虫病-+腺热腺热-+(三三)微生物检验微生物检验1.1.标本采集标本采集(1)(1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，病人血液标本：发热期均有立克次体血症，在急性期较易检出立克次体。争取在用在急性期较易检出立克次体。争取在用抗抗生生 素前采血，立即床侧接种。素前采血，立即床侧接种。(2)(2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。瓣膜等标本。2.2.标本直接检查标本直接检查(1)免疫荧光检测免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片用于脏器检查。制备标本片薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗薄而均匀，

50、组织结构清晰，固定后用荧光抗体染色体染色,常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。(2)核酸检测核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需敏感性高，所需样品量只需ELISA实验的实验的15。以编码。以编码17kD蛋白的基因蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因蛋白的基因作为扩增靶区。作为扩增靶区。n引物引物R17-1、-2在在65条件下能扩增普氏和莫条件下能扩增普氏和莫氏立克次体氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条。在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带；的核酸带

51、；n引物引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体仅能扩增普氏立克次体DNA，产生一条产生一条432bp的核酸带。两种引物同时使的核酸带。两种引物同时使用，扩增后普氏可产生用，扩增后普氏可产生340bp和和432bp两条带，两条带，而莫氏只产生而莫氏只产生340bp一条带。一条带。n该法敏感性可达该法敏感性可达005ngDNA水平，重复性水平，重复性好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值。值。3 3分离培养分离培养(1)动物接种动物接种 选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现选用

52、健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。每日测体温，至象。每日测体温，至40发热时采血或脏器发热时采血或脏器悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体；克次体；感染莫氏立克次体豚鼠在发热感染莫氏立克次体豚鼠在发热12日内出现日内出现阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充血、脾大血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应者，睾倍，有腹水；有阴囊反应者，睾丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物等。鞘膜涂片可查到立克次体。等。鞘膜涂片可查到立克次体。(2)(2)鉴定鉴定n用免疫荧光法鉴定感染动

53、物脏器、鸡胚卵用免疫荧光法鉴定感染动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。作群和种的鉴定。(3)(3)分离株繁殖及保存分离株繁殖及保存鸡胚卵黄囊培养鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染收获卵黄囊，经涂片染色镜检色镜检,含立克次体较多而又未发现细菌含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置液置-70冰箱保存，或冰冻干燥保藏；冰箱保

54、存，或冰冻干燥保藏；细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置次体大量繁殖的感染细胞置-70储存。储存。4 4抗体检测抗体检测立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐反应、间接免疫荧光反应、间接免疫荧光(IFA)试验、酶联免试验、酶联免疫吸附试验疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合外，还有补体结合(CF)试验、微量凝集试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝试验、间接血凝(IHA)试验、胶乳凝集试验、胶乳凝集(LA)试验等试验等。(1)(1)外斐

55、反应外斐反应除除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性外，其他为阳性。外，其他为阳性。患者患者OX凝集素上升较晚，在病程凝集素上升较晚，在病程2周左右方出周左右方出现阳性，病程中双份血清试验，若效价有现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍倍增长，方有诊断意义。增长，方有诊断意义。有些病例在病程中效价不见上升，约有些病例在病程中效价不见上升，约15的的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。清学试验阳性，但外斐反应可为阴性

56、。斑点热病人外斐反应效价通常为斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于高于OX2，但也有，但也有OX2较高者。若仅出现较高者。若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。(2)IFA试验试验为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知立克次体抗原立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养感染鸡胚卵黄囊或细胞培养悬液悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛，制片，以低稀释度的病人血清初筛，有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者，有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者，判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作

57、双倍或双倍或4 4倍稀释以测效价，如呈倍稀释以测效价，如呈4 48 8倍增长倍增长者可明确诊断。者可明确诊断。(3)ELISAn检测检测IgMIgM抗体对早期诊断有价值。抗体对早期诊断有价值。n立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISAELISA测测定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片(经氯仿经氯仿甲醇洗净甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清上，凉干、固定，加稀释血清于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加于抗原点上

58、，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加酶标兔抗人酶标兔抗人IgM/GIgM/G于抗原于抗原血清点作用后，将浸透新血清点作用后，将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-6min4-6min，可，可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条(即终止反应即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结，观察是否显色，与对照比较判定结果。此法简便，并可保存实验记录。果。此法简便，并可保存实验记录。(4)CF试验试验 CF试验原来是立克次体病血清学诊断的试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如经典试验，虽然敏感

59、性不如IFA和和 ELISA，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，血清中即有血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，抗体出现，以后逐渐上升，至第至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染性结果，只能说明该群立克次体的感染。三、恙虫病立克次体三、恙虫病立克次体 又名东方

60、立克次体是恙虫病的病原体，由恙又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成黑色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫源性疾病。源性疾病。(一一)微生物特性微生物特性1具有多形性，但以短杆状为常见。具有多形性，但以短杆状为常见。G-,姬姆姬姆 萨染色呈紫红色萨染色呈紫红

61、色,Gimenez染色呈暗红色，染色呈暗红色，背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体。分布在细胞质内，密集于其他立克次体。分布在细胞质内，密集于 细胞核旁。细胞内寄生细胞核旁。细胞内寄生。2培养特性培养特性(1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于细胞核旁。细胞核旁。(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用胞内

62、生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞细胞进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸附时间，通常以附时间，通常以37吸附吸附1h，培养，培养32为为宜，繁殖缓慢，用宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养细胞培养89d，在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密在细胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。集，但不侵入细胞核。3 3抗原成分抗原成分n恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。性抗原。n恙虫病立克次体和变形杆菌恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的株有共同的抗原成分，在抗原成分，在Weil-Felex反应中，

63、血清与反应中，血清与OX，抗原发生凝集而不与抗原发生凝集而不与OX19、OX2发生凝集。发生凝集。(二二)微生物检验微生物检验(1)抗原检测：抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法。性抗原或抗体的最常用方法。(2)PCR：可检出：可检出20ng恙虫病立克次体恙虫病立克次体DNA；套；套式式PCR法可检出法可检出200pg，是目前最为快速、特，是目前最为快速、特异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期患者的早期诊断。患者的早期诊断。依据依据56KD蛋白抗原基因或蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因蛋白抗原基因序列

64、选择引物，进行目的序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用扩增，然后用15琼脂糖电泳法检出特异性琼脂糖电泳法检出特异性DNA带。带。(3)分离培养分离培养 接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔O5ml，一般多在，一般多在718天死亡，感染小天死亡，感染小鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗出液，以出液，以Giemsa染色镜检，在靠近细胞核染色镜检，在靠近细胞核旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种Vero细胞、细胞、L92

65、9细胞进行立克次体分离培细胞进行立克次体分离培养。细胞培养养。细胞培养1015天，取细胞涂片，天，取细胞涂片，Giemsa染色镜检。染色镜检。(4)抗体检测抗体检测n外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗体体OXk效价达效价达l：160以上有意义，病程中双以上有意义，病程中双份或多份血清试验，若效价有份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有倍增高，有诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫病的诊断方法。病的诊断方法。n免疫荧光试验：快速敏感特异，可分别检免疫荧

66、光试验：快速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在抗体，效价在1：80以上有诊断意义。以上有诊断意义。双份血清有双份血清有4倍或以上增长可以确诊。倍或以上增长可以确诊。四、贝纳柯克斯体四、贝纳柯克斯体n又称又称Q Q热立克次体，是引起热立克次体，是引起Q Q热热(疑问热，指最疑问热，指最初不明病因的发热初不明病因的发热)的病原体。的病原体。n传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。nQ Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其临床特征。和肝炎为其临床特征。n慢性慢性Q Q热主要表现为心内膜炎。热主要表现为心内膜炎。（一）微生物特性（一）微生物特性1.形态与结构形态与结构 个体较小，多为短杆状，常排列个体较小，多为短杆状，常排列成对，成对，Gimenez法染色呈红色，背景呈绿色，法染色呈