南医大药物分析第04章-药物定量分析与分析方法验证.ppt

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1、第四章药物的含量测定方法与验证,药物的含量,指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要指标。,药物的含量通常是采用化学、物理学或生物学的方法进行测定，是评价药物质量的主要手段，是药品质量标准的重要内容。,第一节 定量分析方法的分类与特点 ChP所收载的关于药物含量、溶出或释放测定的定量分析方法主要包括：1. 容量分析法，2.光谱分析法，3.色谱分析法,一、容量分析法 是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。,（一）容量分析法的特点与适用范围,1

2、.特点： （1）方法简便易行 （2）方法耐用性高 （3）测定结果准确 （4）方法专属性差,2.适用范围： 化学原料药的含量测定,（二）容量分析法的计算问题,1滴定度,指每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，ChP用mg表示。,A:被测药物，B：滴定剂,2滴定度（T）的计算,滴定度T,例：用碘量法测定VitC(176.13）m(I2)=0.05mol/l,aMA b WA mBV,m 滴定液的摩尔浓度（mol/l),T:药典规定的摩尔浓度的滴定度,3. 含量计算,（1）直接法,ChP收载的容量分析法，均给出滴定度。根据称取量W、消耗体积V、滴定度T，可求。,实际工作与药典要求存在差异，

3、需要校正。,（2）间接滴定法,1）生成物滴定法,该法的百分含量计算与直接滴定方法同，只是在计算滴定度时需考虑被测药物与中间化合物以及中间化合物与滴定剂三者之间的化学计量关系。,2）剩余滴定法药物+定量过量的滴定液A，用另一滴定液B回滴；考虑空白实验,二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法 1特点紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波 长为200nm760nm 这一范围的单色光辐射的吸收特性所 建立起来的光谱分析方法。主要特点如下： （1）灵敏度高，可达10-4g/ml10-7g/ml ，适于低浓度试样分析。 （2）准确度高，相对误差为2% 5%，适于对测定结果的准确度有较高要求的试样的分析

4、。 （3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。 （4）专属性较差：通常不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。,2郎伯-比耳定律,单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定浓度范围内该物质吸收的量与该物质浓度、液层厚度成正比。,A=Ecl,注意：药物分析中，E通常采用百分吸收系数：,其物理意义为：当待测溶液浓度为每100ml中含待测药物1g，液层厚度1cm时的吸光度值,3仪器校正和检定,（1）波长：允许误差为紫外光区1nm， 500nm处2nm.,（2）吸光度的准确度,（3）杂散光的检查,（4）对溶剂的要求：使用范围不能小于截止使用波长,（5）测定法：需做空白对照,4测定方法,1)对照

5、品比较法,Cx为供试品溶液的浓度; Ax为供试品溶液的吸光度； CR为对照品溶液的浓度；AR为对照品溶液的吸光度。 D 为稀释倍数。,标示量（%）：制剂含量相当于标示量的百分数,单位制剂的平均装量，如：g/片，g/粒，g/ml, ml/ml B:标示量:单位制剂的标示量（ g/片，g/粒，g/ml, ml/ml ）,2）吸收系数法,通常要求吸光系数大于100，注意仪器的校正和检定。,3）计算分光光度法,4）比色法,（二）荧光分析法,方法特点与适用范围 （1）高灵敏度：较紫外-可见分光光度法高，可达10-1210-10 g/ml。 （2）荧光自熄灭：浓度太大，溶液会用“自熄灭”作用，要求在低浓度

6、下进行。 （3）易受干扰：因灵敏度高，干扰因素多，必须做空白试验。,2. 干扰排除 （1）溶剂：测定前检查空白溶剂的荧光强度。 （2）溶液：溶液中待测药物浓度不宜过高；溶液中的悬浮物对光有散射作用；溶液中的溶解氧有降低荧光的作用；控制溶液的pH值。 （3）玻璃量器：要求玻璃量器及样品池保持高度洁净。 （4）温度：测定时要求控制温度一致,3测定法与含量计算,Cx为供试品溶液的浓度; Rx为供试品溶液的荧光强度； CR为对照品溶液的浓度； RXb为供试品溶液试剂空白的荧光强度； Rr为对照品溶液的荧光强度； Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。,要求 在0.52之间,（二）色谱分析法,色谱分析法

7、是一种分离分析方法，系根据混合物中各组分的色谱行为差异，将各组分从混合物中分离后再（在线、离线）选择性对待组分进行分析的方法。,方法特点与适用范围 （1）高灵敏度：最低检出浓度可达10-1510-12 g/ml。 （2）高专属性：有效分离样品中与待测组分结构相近的有关物质，检测信号具有较高专属性，实现选择性检测。 （3）高效能与高速度： 广泛用于复方制剂含量测定,（一） 高效液相色谱法 1对仪器的一般要求 系统适用性实验 （1）色谱柱的理论塔板数（n） （2）分离度 （3）重复性 （4）色谱峰的拖尾因子,.测定法 包括 内标法和外标法 （1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量：,内标法,精

8、密量取药物对照品和内标物，分别配成溶液，精密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。,式中，As为内标物质的峰面积（峰高）；AR为对照品的峰面积（峰高）；Cs 为内标物的浓度；CR为对照品的浓度。,式中，AX为供试品的峰面积（峰高）；CX为供试品的浓度；f为校正因子；AS和Cs分别为内标物质的峰面积（峰高）和浓度。,（2）外标法测定供试品中主成分含量： 外标法可分为标准曲线法和外标一点法。 1）标准曲线法： 2）外标一点法：,(二) 气相色谱法 1.对仪器的一般要求 2.系统适应性实验 3.测定法,第二节 定量分析样品的前处理方法,一、概述 分析含金属或含卤素、氮、硫、磷、硒等特殊元素药物

9、分析的前处理方法。 含金属或卤素的药物，如葡萄糖酸锑钠，硬脂酸镁、碘苯酯、磺溴酞钠等，处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固；,而含金属的有机药物，有两种情况： 一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定； 二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，

10、结合状态比 较牢，称为有机金属药物.在溶液中其金属一般不能解离成离子状态，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。,一、不经有机破坏的分析方法 （一） 直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C-M （金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物， 在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方 法进行测定 。,（二）经水解后测定法 1直接回流后测定法 2用硫酸水解后测定法 （三）经氧化还原后测定法 碱性还原后测定,二、 经有机破坏的分析方法 （一） 湿法破坏 1 硝酸-高氯酸法 2 硝酸-硫酸

11、法 3 硫酸-硫酸盐法 4 其它湿法,（二） 干法破坏,（三） 氧瓶燃烧法 氧瓶燃烧法（oxygen flask combustion method）系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。,本法是快速分解有机物的简单方法，它不需 要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定 量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。 1 仪器装置 燃烧瓶为500ml、1000ml、或 2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空 心、底部熔封

12、铂丝一根（直径为1mm），铂丝下 端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的23 ， 如图,2 称样 3 燃烧分解操作法 4 吸收液的选择,（ 2） 仪器与材料,仪器装置 燃烧瓶为250、500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,称样用材料及称样 A. 固体样品 无灰滤纸 B. 液体样品 纸袋,C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹,样品的燃烧 点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置

13、15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,吸收液,A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。,氧气,B. 吸收液的选择,氟 水 （HF） 氯 NaOH溶液（HCl) 溴 H2O2-NaOH(NaOH饱和溶液-SO2(Br2,HBr) 碘 NaOH饱和溶液-SO2(I2,HI) 硫 浓H2O2溶液 硒 硝酸溶液,（3）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备 用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立

14、即用表面皿覆盖瓶口。 样品的准备 取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,（5）应用,例 磺溴酞钠的含量测定 ChP (2000),溴 取本品约0.2g，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，选用1000ml燃烧瓶，以0.4%氢氧化钠溶液10ml，浓过氧化氢溶液0.5ml与水10ml作为吸收液，生成的烟雾完全吸入吸收液后，用水稀释至100ml，煮沸5分钟，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加硝酸银滴定液（0.1mol/l）20ml，摇匀，再加硫酸铁胺指示液2mL，用硫氰酸胺滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/

15、L)相当于7.990mg的溴(Br)。,例 碘苯酯的含量测定 ChP（2010）,原理 碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液2ml与水l0ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，

16、振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02 Mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的计算 放大反应,2mol碘苯酯1molI2 1molI21molNaIO+1molNaI 1molNaIO1/3molNaIO3+2/3molNaI,即2mol碘苯酯2molNaIO3,2mol NaIO3+10I-6molI2,即2mol碘苯酯1mol I

17、2 6mol I212mol I12molNa2S2O3,反应摩尔比为16,98：140. 氧瓶燃烧法中的装置有 A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 磨口软质玻璃锥形瓶 C. 铂丝 D. 铁丝 E. 铝丝,选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品 A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 铂丝 C. 普通滤纸 D. 氢气 E. 无灰滤纸,99：76氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为 A. H2O2溶液 B. H2O2NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼饱和液 E. NaOH硫酸肼饱和液,.氧瓶燃烧法可用于 A. 含卤素有机药物的含量测定 B. 醚类药物的含量测定 C. 检查甾体激素类药物中的氟 D.

18、 检查甾体激素类药物中的硒 E. 芳酸类药物的含量测定,第三节药品质量标准分析方法验证 验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、日间和日内精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性范围和耐用性。 一、 准确度 （一）含量测定的准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程 度，一般以回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内建立。 回收率的计算可按下式：,二 、 精密度 精密度系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多 次取样测定所得的结果之间的接近程度。 (一)精密度表示方法 1.偏差(deviation，d ) .标准偏差(standard deviation ，SD

19、),3. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD ),也称变异系数(coefficient of varation,CV ),(二) 重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性 在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的 精密度称为重复性。 2中间精密度 同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。 3重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。,(三) 数据要求 三、专属性 专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可 能存在下，采用的方能准确测定出被测物的特性。 (一)鉴别反应 (二) 含

20、量测定和杂质测定 四、 检测限 检测限（limit of detection，LOD）是试样中被测物能被检 测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，即反映 方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白 （本底）值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该 规定的浓度或量即可。根据所采用的方法来确定检测限。,(一)常用的方法 1. 非仪器分析目视法 2. 仪器分析时的测定法 （二）数据要求 五、定量限 定量限（limit of quantitation ，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。,六、线性 线性 系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓 度直接呈正比关系的程度。,七、范围 范围是指能到达一定精密度、准确度和线性、测试方法适用 的高低限浓度或量的区间。 八、耐用性 耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响 的承受程度，为常规检验提供依据。 1用于鉴别试验 2用于原料药中杂质测定或制剂中的降解产物测定的方法 3用于原料药中主成分或制剂中有效组分含量测定及溶出 度测定,