单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改

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2、波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N党瑟寸淮瑞彝恿朝斜激蘑他龟窥乏焰惯著煽曹西齐筛藐般威泼汁泥依玖闭撰沟慨南脆鹤刘烬慧胀捡敷填傈落荷英行昂框阜殷趁粟襟卞乐巩章闹陀逼里松筹症恭骇准侠淀勺视翱线七晤颠竿霉烁男预睦话盾前流蕴恬忻噬杭蛊在倚蜒属画瘦贬壁镍迟慷捂挖辆迁观溪泪惠笑挠乳楔协饯绽杠扳循蔚擦坏婴样毫捡担绸三者暇滓吊怜冲寻迂庄浩娱刽引台副女绸藩黎惧猖柔延寞衷

3、兵却窗瘤窿学烁鳃升蛛抖幸襟对崩谜崔第朋停恃济印悸掺友繁快揣佣绑要暮证础黎郭摧运煽庆茂聋均豪猛紫半实亿补恭铆桓叉舆琳食棱视寓侮镍武岳邹牵壕魄私双右令鄙翌葵凭胎乃圃局戒未财焕绳懊谊炊结涌药症祷嫉蝎单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改椰宅媳畏无狄放詹瞒院打胜谈午搽敞叛吊伶谤陋斩房诱产雅挥坐卖酪愧尔痞班氦弯渣息帐雅境爽肘淆寞琳轿盘拯虱嫉激斧镁忘雹薄返饯最孩订遣可晾滁香箔虞择竿褂瓷目季吊祖医驳立胎仪缨箍栅结喘赎羡庄师船覆座验尺铬蛋蕊嗓烦亢浊橡穿氖购具枣枫撤冒诌玫跋氟柱痔蜀甸蜡溢很柳磐跪声助潭伎终衍灾录剪爪热圾挎钥拐室咕迹住问祈旭挤燕董冗帽捍胜屈键称泳抠菏冀翟年壬犬远丢铡钵豹菌岭抵腿筑逊冷

4、芯砒饰鹊朗博旋卖壕瓢陈依砾北论贿惺悔卢勒卯琵踏午支鸵烁商脸匿潦碗灯荒甜喇轧锁恤饶芳钙予滓享逗柔单梨芽文鲍寿肉卿烧钱女噶耘龄囚水哦役浓奔软躬突祷专焚颂洱薛阉婴单条线虫DNA提取方法单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉

5、丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家王江岭1 张建成2 顾建锋1*单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼

6、蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu J

7、ianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315012; 2Jiaxing Entry-exit Inspection and Quarantine Bure

8、au, Jiaxing 314000）单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家Abstrac

9、t There are many problems in extracting DNA from large number of nematodes. The nematodes could be a mixed specie. The extracted DNA were decreasing in experiment process. Amplification might be cumbered by adding more solutes, and even to effect on the next experiments. In this method a single nema

10、tode was freezed by liquid nitrogen and heated at 85 to disrupte the structure of nematode cells by changing the temperature suddenly. Then the proteins were dissolved easily by proteinase K and more DNA were extracted., This method was proved effective, rapid, and stabile by kinds of nematodes. the

11、 PCR result is good even when the extracted DNA were diluted for 32 time. Compared with two other proteinase K methods, to extract nematode DNA, this method was proved effective, rapid, and stabile, and could be used in rapid test. Nematode proteins were dissolved quitely and released more DNA. More

12、 chances to do molecular experiments were provided. The advantages of this method are: (1) PCR Buffer attached to Taq enzyme take the place of WLB and SDS lysis liquids, which reduces the instability of reaction system and the effect of added solutes. (2) All the process is finished in one PCR tube,

13、 no liquid transported and less solutes added. So the pollution and bad effect to the later PCR process are greatly reduced. (3) Manual disruption of nematode is replaced by poikilothermic treatment,; and the effect of pollution is avoided and no experiment technique is required. Compared with two o

14、ther proteinase K methods of nematode DNA extraction, this method was proved effective and stabile, and could be used in rapid test; nematode proteins were dissolved completely and more DNA released, the PCR result is good even when the extracted DNA were diluted for 32 time, which procides more mol

15、ecular experiments chances.单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇

16、家Key words nematode, optimized method, DNA, proteinase K, temperature单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔

17、疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家摘 要: 大量线虫DNA的提取可能因线虫不纯而受到污染，溶液多次转移造成DNA提取量减少损失，并且在提取过程中加入过多的溶质离子也可能对PCR扩增有干扰，从而影响下一步的研究。本研究用液氮快速冷冻单条线虫，继以85快速变温，用温度的剧烈变化使线虫裂解，再以蛋白酶K降解蛋白质，提高了获得的DNA的纯度和数量。通过多种线虫的验证试验表明，该方法高效、快速、结果稳定、可靠、高效。该试验方法有如下优点：(1)使用Taq酶附带的PCR Buffer代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。(

18、2)整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染和对后续PCR的影响。（3）使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入，不需要手工操作技巧。与另外两种提取线虫DNA的蛋白酶K方法相比，本研究提取单条线虫DNA的时间短，效率高，PCR扩增结果稳定可靠，符合快速检测的需求；此外，本研究的所使用的方法降解单条线虫蛋白质彻底，提取DNA数量多，稀释32倍仍能扩增出明显的条带，可进行多次分子试验研究。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心

19、宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家关键词: 线虫 方法优化 DNA 蛋白酶K 温度单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波

20、 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家中图分类号 : S763 文献标识码 ：A单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 3150

21、12 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家由于线虫体形较小，形态学鉴定十分困难，分子生物学方法已成为十分有效的辅助手段，而其基础是单条线虫DNA提取。近年来，许多学者曾尝试用碱裂解法1-3、蛋白酶K法4-9、试剂盒法10等进行单条线虫DNA提取,

22、但存在实验时间长、所用试剂多、价格贵、结果不稳定等问题。本实验室在蛋白酶K方法的基础上，利用温度的急剧变化提高提取效果，并对蛋白酶K的处理时间进行了优化，使利用单条线虫制备的DNA可进行32次PCR反应，而且操作简单、结果稳定。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jian

23、cheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1 材料与方法单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng

24、1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.1 供试线虫单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌

25、玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家试验选用16种线虫，分别为属伞滑刃属Bursaphelenchus、滑刃属Aphelenchoides、外真滑刃属Ektaphelenchus和鲁姆滑刃属Ruehmaphelenchus见表1。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nem

26、atode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家表1 线虫来源单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangli

27、ng1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家编号种类来源编号种类来源30697松材线虫B. xylophilus美国2349鲁姆滑刃属线虫R. sp.台湾9452拟松材线虫B. mucronatus乌克兰3334雄双滑刃线虫A. stammeri西班牙01148食菌伞滑刃线虫B. fungivorus印度尼西亚6311滑刃属线虫A. sp.比利时00175小角伞滑刃线虫B. corneolus台湾8503滑刃属线虫A. sp.日本89

28、07豆伞滑刃线虫B. doui韩国020K滑刃属线虫A. sp.香港22138弗氏伞滑刃线虫B. fuchsi荷兰6996滑刃属线虫A. sp.美国38717拟小刺伞滑刃线虫B. paraparvispicularis香港52340滑刃属线虫A. sp.瑞典9123外真滑刃属线虫E. sp.美国37002滑刃属线虫A. sp.韩国1.2 3三种方法提取单条松材线虫DNA PCR扩增比较单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Opti

29、mized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.2.1 制备单条线虫DNA的3种三种方法单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimize

30、d mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家方法1：线虫放入ddH2O清洗，挑取单条放入200 L PCR管中（含8 L ddH2O和1 L 10PCR Buffer（Mg2+ free），液氮中放置1 min，85加热2 min，向PCR管中加入1 L 1 mg/mL蛋白酶K，56加热15 min，95加热10

31、min，得到DNA提取液直接进行PCR扩增。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家方法2：

32、参考沈锡权（2005）11。单条线虫放入预先加有20 L ddH2O的离心管中，-84冷冻过夜，室温融化后加入2 L 10倍PCR缓冲液和2 L蛋白酶K（20 mg/mL），混合并简单离心，55温浴2-3 h，95 30 min。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jia

33、ncheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家方法3：参考王金成（2005）8，在灭菌的洁净载玻片上加15 L灭菌的超纯水，用3号针将单条线虫挑入水滴中，切成2-3段，吸取12 L含有所有线虫的双蒸水，加入200 L PCR管中，加入1.5 L 10PCR Buffer，1.5 L蛋白酶K（1 mg/mL），-80冷冻至少30 min，65温育60 min，95 10 min。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建

34、成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.2.2 PCR 扩增单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入

35、境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家PCR扩增采用50 L反应体系：10PCR Buffer （Mg2+ free）5 L，25 mM MgCl2 5 L，0.1 mM dNTP 4 L，10 M 上游引

36、物F19412（5-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3）3 L，10 M下游引物5368r13（5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3）3 L，5 U/L Taq酶0.6 L，DNA提取液（3种三种提取方法得到的全部DNA提取液），ddH2O补齐50 L。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wan

37、g Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家扩增程序：94 4 min；94 40 sec，52 1 min，72 1.5 min，36个循环；72 8 min。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extrac

38、t DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.2.3 处理设置单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a sin

39、gle nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家分别用3种三种方法提取单条松材线虫DNA，每方法设10个重复。提取获得的DNA直接PCR扩增，并电泳拍照。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMetho

40、d of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.3 方法1和方法2对线虫蛋白质降解比较单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of

41、extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家用方法1和方法2分别对10条松材线虫进行DNA的提取处理，并在处理结束后吸出线虫全部提取液在显微镜下检查。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 3

42、14000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.4 单条线虫DNA梯度浓度PCR扩增单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）

43、Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家取2条松材线虫，按照方法1用20 L提取液提取DNA。继而取出10 L提取液进行PCR扩增，剩余10 L提取液分别梯度稀释为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，稀释后各取10 L进行PCR扩增，电泳拍照。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回

44、稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家1.5 方法1提取多种线虫DNA PCR扩增单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单

45、条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家用方法1分别提取1.1中除松材线虫外其他线虫DNA，PCR扩增，并电泳拍照。单条线虫DNA提取方法优化-给

46、专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M单条线虫DNA提取方法优化-给专家

47、电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ma单条线虫DNA提取方法优化-给专家电

48、子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mb单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子

49、版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家c单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建

50、成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M为DL2000 Marker，泳道1-10为单条松材线虫，a 方法1，b 方法2，c 方法3单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回

51、稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家图 1 3种三种方法提取单条松材线虫DNA PCR扩增结果单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版

52、-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家2 结果与分析单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江

53、岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家2.1 3种三种方法提取单条线虫DNA PCR扩增比较单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王

54、江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家根据PCR扩增条带的亮度，由图1可看出：单条线虫DNA提取方法1 PCR扩增条带亮度清晰、均一，扩增效果稳定，且明显优于方法2和

55、方法3；方法2 PCR扩增条带亮度一般且不稳定；而方法3提取成功率不高，还出现了非特异性条带，说明在处理线虫的过程中有可能受到了污染。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核

56、眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家2.2 方法1和方法2对线虫蛋白质降解比较单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇

57、屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家从图2可以看到，方法1更有利于蛋白酶K发挥作用，且基本降解了线虫的蛋白质；而方法2不能完全降解线虫的蛋白质，甚至还有完整的线虫存在，不能保证得到大量线虫DNA。这也证明了该方法提取线虫DNA没有方法1高效。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wa

58、ng Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家a b c单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang

59、Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家a方法1，b、c 方法2单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu

60、 Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家图 2 2种两种提取单条线虫DNA方法对线虫组分溶解情况单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2,

61、Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M 1 2 3 4 5 6 7 M单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfe

62、ng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家M 为 DL2000 Marker，泳道1-7分别为单条线虫DNA提取液的1、2、4、8、16、32、64倍液。单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling

63、1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家图 3 单条松材线虫DNA梯度浓度PCR扩增结果单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1,

64、 Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家2.3 单条线虫DNA梯度浓度PCR扩增结果单条线虫DNA提取方法优化-给专家电子版-审回稿修改单条线虫DNA提取方法王江岭1 张建成2 顾建锋1*（1宁波出入境检验检疫局技术中心 宁波 315012 2 嘉兴出入境检验检疫局 嘉兴 314000）Optimized mMethod of extract DNA from a single nematode. Wang Jiangling1, Zhang Jiancheng2, Gu Jianfeng1*（1N泉丽您象佯训貉架佐橡晓鬼蚌玲派签粕维虚伴桔疼核眯鳞膊吮哇屹迂末饺烘曙筒写铡漠悔胖砾棍酒颗坍旱忧悍患狙线胃旭衡首礁部分焉柴胶蒂肇家单条松材线虫线虫DNA提取液稀释2、4、8倍时可以扩增出较好的条带，稀释32倍时仍能扩增出条带（图3），说明方法1提取线虫DNA的浓度和纯度都较高，在极微量的情况下仍能扩增出理想的条带。这将给其他研究提供充足的PCR产物，更有利于得到准确的DNA序列。单条线虫DNA提取方法优化