多齿配体合成(精品)

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1、多齿配体的合成及其金属配合物对DNA的切割研究王潇 毛宗万基金项目 中山大学化学与化工学院第四届创新化学实验与研究基金项目（批准号：03023）第一作者 王潇（1983年出生），女，中山大学化学与化工学院应用化学专业00级联系人 毛宗万 Email：cesmzw（中山大学化学与化学工程学院，广州 510275）摘要 合成了6,6-二二(吡啶甲基)胺甲基-2,2-联吡啶配体，用元素分析、质谱和核磁共振技术对它们进行了表征通过紫外吸收光谱和荧光猝灭研究了小牛胸腺DNA与铜配合物的相互作用，通过凝胶电泳研究了铜配合物及镧配合物对超螺旋pBR322DNA的断裂，发现镧配合物能快速切割超螺旋DNA为线型

2、DNA，并对其进行了动力学研究，得到了它的催化速率常数以及米氏常数，对其切割能力进行了讨论关键词 DNA 铜（II）配合物 镧（III）配合物 凝胶电泳 水解断裂脱氧核酸酶在基因组和染色体作图和测序、控制基因表达和调控基因生物活性等领域有着广阔的应用前景。但天然限制性内切酶识别序论短、专一性强，不能满足分子生物学和生物工程的需要。近十年来，人工脱氧核酸酶的开发研究及与此相关联的金属配合物与DNA相互作用的研究十分活跃1-4过渡、稀土金属多吡啶配合物广泛地被研究用于DNA构象变化的探针、DNA-蛋白质相互作用分析的足迹试剂、以及基因组和染色体作图和测序的工具试剂等5,6 许多金属离子及其络合物都

3、可以作为Lewis酸而催化核酸水解它们有3个方面的催化作用：（1）它们可以与核酸上的磷氧负电荷结合从而提高磷原子的亲电性，这有利于亲核试剂进攻形成五配位磷过渡态；（2）它们可与过渡态中带部分负电荷的离去基团结合，帮助其离去；（3）H2O与金属离子结合后，可以生成与其络合的氢氧根离子作为亲核试剂7因此在本论文中我们设计并合成了一种带有多氮芳香环的联吡啶线形三核配体，希望与DNA的链状结构相匹配，从而能对DNA进行有效的切割我们对其进行了表征，系统的研究了其金属配合物与DNA的作用方式及断裂DNA的活性1 实验部分合成1. 1 仪器与试剂德国Elementar公司VarioEL元素分析仪，美国Th

4、ermo Finnigan公司LCQ DECA XP液相色谱质谱联用仪(配备ESI和APCI)，美国VARLAN公司CAY100紫外可见分光光度计，Varian INOVA核磁共振仪(500MHz)美国，北京市六一仪器厂电脑三恒多用电泳仪（DYY-12型）小牛胸腺DNA(CT DNA)购自华美公司，pBR322DNA，三羟甲基氨基甲烷（Tris），N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠（HEPES Sodium Salt），乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA Disodium Salt），购自上海生工公司，二(2-吡啶甲基)胺，6,6-二甲基-2,2-联吡啶，购自Aldrich公司 其它试剂均为分析纯

5、实验用水均为去离子重蒸水1. 2 6,6-二溴甲基-2,2-联吡啶的合成8称取6,6-二甲基-2,2-联吡啶1.000g(5mmol)，N-溴代丁二酰亚胺1.932g（10mmol）至100ml圆底烧瓶，再加入50ml四氯化碳，于80回流半小时后，加入过氧苯甲酰15mg，继续回流2小时结束反应趁热抽滤除去白色固体，并用少量四氯化碳洗涤，将滤液置于低温反应器内，搅拌使产品结晶析出，过滤，将白色固体干燥产率33，测其熔点172.0172.91. 3 6,6-二二（吡啶甲基）胺甲基-2,2-联吡啶的合成9称取二（2-吡啶甲基）胺0.6g（3mmol），三乙胺0.306g（3mmol），四氢呋喃15m

6、l至25ml圆底烧瓶，再加入0.513g（1.5mmol）6,6-二溴甲基-2,2-联吡啶，于90回流5小时趁热抽滤去白色固体，滤液旋转蒸发蒸去四氢呋喃，得黄色粘稠液体液体用少量的甲醇溶解，滴加浓高氯酸至沉淀不再析出。冷却静置2天，倒出溶液，真空干燥，得黄色固体，产率为81363484HClO45H2O EA（实验值: C,40.27; H,4.350; N,10.21, 计算值: C,40.39;H,4.520; N,10.47）, ESI-MS（实验值: L+H+,579.3; L+H2+,290.2, 计算值: L+H+,579.7; L+H2+,290.4）, 1HNMR, H(氘代D

7、MSO): 7.459-8.642(11H, m, ArH), 4.197(6H, s, NCH2Py)研究方法1. 4 DNA与配合物相互作用时的热变性研究 在紫外可见光谱仪的双光路系统中，参比池中加入3mlTris缓冲溶液(PH=7.0)，样品池中加入同样体积的100mol的DNA溶液，在200300nm范围内检测DNA电子的吸收光谱的变化温度范围为5094，其中5070的升温间隔为5，7094的升温间隔为3这样测得的就是空白DNA的解旋温度。按此方法，分别测定铜配合物浓度与DNA浓度比为0.1、0.3、0.5时DNA的解旋温度1. 5 配合物与EB-DNA体系相互作用的荧光猝灭研究 研究

8、配合物与DNA作用时，样品均溶解在缓冲溶液(5mMTris和50mMNaCl，PH=7.0)中小牛胸腺的浓度以260=6600M-1cm-1来确定测试液按固定DNA的浓度逐渐增加配合物浓度的方法配制1. 6 凝胶电泳 固定DNA浓度逐渐增加配合物浓度做反应时间的变化，反应后进行凝胶电泳(100mV，120min)，染色后在紫外灯下拍照铜配合物：37，pH=7.2(HEPES)，pBR322DNA:0.025mg/mL，配合物:150mol，0.25溴酚蓝镧配合物：37，pH=8.1(Tris)，pBR322DNA:0.025mg/mL，配合物:30、40、50、200、300mol反应终止液:

9、50甘油水溶液，0.02mmolEDTA；电泳缓冲液:1TBE硼酸溶液系统(pH=8.3)；染色剂:0.51.0g/L溴乙锭(EB)2 结果与讨论2. 1 DNA与配合物相互作用时的热变性研究 在配合物存在下测定DNA溶液的热变性行为有利于了解它的构象变化及配合物对DNA的作用强度通常有机染料或金属插入剂通常导致DNA双螺旋链的稳定性升高，其熔点因此也会被升高10配合物与DNA作用后的相关数据见表1DNA的TM均升高，说明配合物与DNA之间有较好的亲和作用 表1 CT DNA与配合物相互作用时的解旋温度变化配合物complex/DNA TM() Cu3L 0.1 1.982 0.3 2.317

10、 0.5 2.661其中，TM() 加入配合物后的熔点-DNA空白的熔点2. 2 配合物与DNA相互作用的荧光猝灭研究如果配合物与DNA相互混合后，其荧光光谱发生了变化，表明了配合物与DNA之间发生了某种方式的相互作用因此，在DNA存在下配合物荧光光谱强度的变化都可能是配合物与DNA的相互作用的有力证据在该体系中，荧光强度被猝灭的程度越大，表明配合物与DNA的结合越强11这是由于配合物的竞争键合DNA导致了EB分子从插入到的DNA分子中被取代出来，EB的荧光被溶剂分子所猝灭图1是体系的荧光强度随配合物浓度增加的变化曲线，结果表明，体系的荧光强度随着配合物浓度的增加而逐渐减小，结合热变性研究说明

11、它与DNA之间有较强的亲和作用图1 铜配合物对EB-小牛胸腺DNA体系荧光强度的影响Cu3L(H2O)4（）, EB（in the absence of DNA）（）2. 3 凝胶电泳结果讨论 DNA 0 4 8 12 16 20 24h DNA 0 0.25 0.5 1 2 3 4h （A） （B） 图2 铜配合物断裂pBR322DNA的凝胶电泳图（A）和镧配合物断裂pBR322DNA的凝胶电泳图（B）从图中可以看出铜配合物切割pBR322DNA的效果远远不如镧配合物，它虽然在20h可以将超螺旋构型（Form I）完全切割，但线型（Form III）却不明显，说明其对缺刻型（Form II）

12、的切割能力并不强而镧配合物在半小时就有强烈的线型产生，所以我们对其做了不同浓度的时间变化，进行了进一步的动力学研究结果见图3图3 配合物浓度与催化速率常数的拟和曲线由上图计算得出KM 2.0410-5mol/L，kcat 1.84h-1 这与文献相比较已经是一个很高的值，而且达到这个速率一半所需要的配合物浓度仅仅为20mol，可见它的断裂能力非常强3. 结论热变性实验说明铜配合物与DNA有很好的亲和作用，荧光猝灭实验进一步说明铜配合物与DNA之间是插入作用凝胶电泳结果表明铜配合物和镧配合物均能有效断裂DNA双链，特别是镧配合物能快速切割超螺旋DNA为线型DNA，是一个很强的DNA切割试剂致谢

13、感谢中山大学化学与化工学院第四届创新化学实验与研究基金对本工作的资助参考文献1 Tamas Gajda, et al. Highly Efficient Phosphodiester Hydrolysis Promoted by a Dinuclear Copper() Complex. Inorg Chem, 2001, 40, 491849272 Pyle A, Barton J K. In: Lippard S J, ed. New York: Wiley, 1990, 4134753 Arkin M R, Stemp E D A, Holmlin R E, et al. Rates o

14、f DNA-mediated electron transfer between metallointercalators. Science, 1996, 273: 4754804 Murphy C J, Arkin mol R, Jenkins Y, et al. Science, 1993, 262: 102510295 Holmlin R E, Dandliker P J, Barton J K. Charge transfer through the DNA base stack. Angew Chem Int Ed Eng, 1997, 36: 271427306 Burrows C

15、 J, Muller J G. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scisson. Chem Rev, 1998, 98:110911517 万荣，赵刚，陈晶，麻远，赵玉芬，科学通报，2000，Vol.45，No.8，7858 Rodriguez-Ubis J.C., Alpha B., Plancherel D., Lehn J.M., Helvetica Chimica Acta., 1984, 67, 2264.9 Yuzo Nishido, Hiroyuki Shimo, Sigeo Kida, J. Chem.

16、Soc. Chem. Commun, 1984, 161110 Neyhart G. A., Grover N., Smith S. R, Kalsbeck W. A., Fairly T. A., Cory M., Thorp H. H., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 4423.11 Pasternack R. F., Caccam M., Keogh B., Stephenson T. A., Williams A. P., Gibbs E. J., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 6835.Synthesis of multip

17、le chelating metal complex and DNA cleavage studiesXiao Wang Zong-Wan Mao* (School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yet-sen University, Guangzhou 510275)Abstract The ligand，6,6-Dibis(pyridin-2-ylmethyl)aminomethyl-2,2-dipyridyl has been synthesized and characterized by EA, ESI-MS and 1HNMR

18、techniques. The binding of the complexes with calf thymus DNA has been investigated by ultraviolet absorption and fluorescence quenching technique. The lanthanum complex can cleave supercoiled DNA into linear DNA rapidly. So its capability is also discussed in detail. Keywords DNA Cu(II) complex La(III) complex gel electrophoresis hydrolytic mechanisms138