土壤微生物的分离鉴定

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1、土壤微生物的分离鉴定试验一 土壤的采集一、实验目的：学习土壤的采集、处理方法二、实验原理：土壤样品的采集方法对分桥结果和评价至关重要。因此，采集的样品必须具有代表性。三、实验器材无菌牛皮纸袋，无菌铲，长线，标杆，标签四、试验方法：由于土壤自然条件、类型和污染状况不同，采样的方法也不同，按照“随机”、“等量”和“多点混合”的原则进行采样，常用的方法有：(1)对角线采样法。这种方法适宜于受到废水污染或污水灌溉的田块。由田块进水口向对角引一条斜线，将此线分成三等份或五等份，在每等份的中央点取样。(2)蛇形采样法。这种方法适宜于面积较大，地形不平坦，土壤不均匀的田块。采样品按蛇形多布置一些。(3)棋盘

2、形采样法。对于面积适中、地势平坦，地形完整的田块，适合用这种采样法。如土壤不均匀，布置10个以上的采样点土壤均匀，采样点可少些。(4)梅花形采样法。对于面积不大，地势平坦，土壤较均匀的田块，适合用这种方法。梅花形采样的布点以510个为宜。用上述采样法采样应注意采样深度、采样时间、采样量及样品的处理和保存。（5）一个混合土样以取土1公斤左右为宜，如果样品数量太多，可用四分法将多余的土壤弃去。方法是将采集的土壤样品放在洁净的塑料布上，弄碎、混匀，铺成四方形，划对角线将土样分成四份，把对角的两份分别合并成一份，保留一份，弃去一份。如果所的样品依然很多，可用四分法处理，直至所需数量为止。 (1)采样深

3、度，对一般土地采样深度1530cm即可。对根深的作物可取至50cm的深度。大田作物采样深度一般为0-20厘米，菜田0-25厘米，果园0-40厘米。采样时深度要垂直，上下取土量要一致(2)每个采样点的取土深度及采样量应均匀一致，土壤上层与下层的比例要相同。取样器应垂直于地面入土，深度相同。用铁锨取样应先铲出一个耕层断面，再平行于断面下铲取土。(3)采样时间，粮食作物及蔬菜在收获后或播种前采集，随时采样分析(4)采样量，12kg土量。（5）预处理及保存将采集的样品平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并拣除植物根、茎、叶及石块杂物，经20号筛筛分。（6）样品标记：采集的样品放入统一的灭过菌

4、的牛皮纸袋样中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。注：耕种田、肥沃的土壤有机质充足，阳光水分充足，适合细菌和放线菌；要采集霉菌、放线菌要到森林、植被等湿润的地方。采集的菌种最好在春季和秋季，此时的微生物生长旺盛，如果是极端环境生长的菌种除外。实验二制备土壤稀释液一、实验目的：学习用浓度梯度法配置土壤稀释液二、实验仪器及试剂：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸头、试管、无菌水、土样三、实验步骤：称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5m

5、L无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，各种稀释度的土壤溶液。注：无菌操作：【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细

6、胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分

7、别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。实验三培养基的制备一,实验目的学习细菌,放线菌及真菌常规培养基的制备方法;二,实验内容牛肉膏蛋白胨培养基的制备;高氏一号合成培养基的制备;马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备;三,实验原理培养基(culture medium)是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质,主要用于微生物的分离,培养,鉴定,菌种

8、保藏或积累代谢产物等方面.其种类很多,依微生物的种类,营养类型以及研究目的的不同而异,实验教学常用的有以下三种.牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基.在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基.加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离,培养和测数等.高氏一号培养基是一种合成培养基,常用于分离和培养放线菌.马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基,常用于分离和培养多种真菌.四,实验材料1,药品和试剂:牛肉膏,蛋白胨,NaC1,10%NaOH溶液,10%盐酸溶液;可溶性淀粉,K2HPO4,MgSO47H2O,KNO3,NaCI,FeSO47H2O,琼脂.2,材料:新鲜马铃薯,蔗糖或葡萄糖.五,实验

9、用品小铝锅,天平,牛角匙,1000mL刻度搪瓷杯,玻棒,pH试纸,分装漏斗,衣棉,橡皮圈,100 mL烧杯,标签纸,电炉,菜板,小刀,纱布,18mm180mm试管.六,实验方法(一)牛肉膏蛋白胨培养基的制备1,培养基配方牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaC1 5.0g,琼脂20.0g,自来水1000 mL,pH7.0.2,操作步骤 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,加50 mL自来水,置电炉搅拌加热至牛肉膏,蛋白胨完全溶解. 向小铝锅中加入500 mL自来水,将溶解的牛肉膏,蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗23次.加入5.0gNaC1,在电炉上边加热边搅拌. 加入洗净

10、的琼脂条,继续搅拌,加热至琼脂完全熔化,补足水量至1000 mL. 用玻棒沾少许液体,用pH试纸测定pH值.用NaOH或HC1调至pH7.0. 分装漏斗分装于18mm180mm试管中,塞好棉塞,装入小铁丝筐,然后用旧报纸将棉塞部分包好.是否可以搁置几天后进行灭菌 高压蒸汽灭菌,121灭菌30min. 分装到试管中的培养基灭菌后趁热摆放斜面.(二)高氏一号合成培养基的制备 培养基配方可溶性淀粉20.0g,硝酸钾1.0g,K2HPO40.5g,MgSO47H2O 0.5g,氯化钠0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,蒸馏水1000 mL,pH7.27.4.2,操作步骤 用搪瓷杯量取自来水500

11、 mL置小铝锅中,在电炉上加热. 根据培养基配方,依次称取各种药品加入搪瓷杯中,搅拌均匀.其中可溶性淀粉称入100 mL烧杯中,加入50 mL自来水调成糊状,待培养液沸腾时及如铝锅中,边加边搅拌,以防糊底. 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至熔化,补足1000 mL水量,调pH7.27.4. 趁热分装于18mm180mm试管,斜面试管每管8 mL,若倒平板则每管装15 mL,装量根据需要而定. 塞好棉塞,装入小铁丝筐,并用旧报纸将棉塞部分包好,贴好标签. 高压蒸汽灭菌,121灭菌30min. 若有斜面试管,在灭菌后及时摆放斜面.(三)马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备1,培养基成分去皮的马铃薯200g ,蔗

12、糖或葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000 mL,pH 自然2,操作步骤 称取去皮新鲜马铃薯200g 切成1cm 见方小块放于小铝锅中,加1000m L 自来水,置电炉上煮沸20min 后,用双层纱布过滤.滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸. 加入称好的蔗糖,琼脂,加热搅拌至琼脂完全熔化,并补足水量至1000m L. 趁热用分装漏斗分装于18mm180mm试管,斜面以8 m L为宜,柱状15m L为宜.分装完毕后做好棉塞,装入小试管筐并捆好,写好标签. 高压蒸汽灭菌,121灭菌30min.若需摆斜面,灭菌后趁热摆成斜面.实验四 接种和培养一、 试验目的：1、学习各种不同的接种方法；2、学习各种实

13、验仪器的正确使用；二、实验原理：微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的最基本操作技能.无菌操作是微生物接种技术的关键,几乎贯穿于所有的微生物学实验过程中.因实验目的,培养基种类,实验器皿以及培养方式等不同,所用接种方法和接种工具也不尽相同.斜面接种,液体接种,平板接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的.因此,接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作.由于接种目的不同,采用的接种工具也有区别,如固体斜面培养体转接时用接种环;穿刺接种时用接种针,液体转接用移液管或移液枪等.三、实验仪器：接种环,接种针,接种铲,移液管,无菌玻璃涂棒,无菌移液管,无菌滴管或移液枪等接种环:

14、是最常用的接种工具,供挑取菌苔或液体培养物接种用.环前端要求圆而闭合,否则液体不会在环内形成菌膜.根据不同用途,接种环的顶端可以改换为其它形式如接种针,接种钩等(图4-5).玻璃刮铲:是用于稀释平板涂抹法进行菌种分离或微生物计数时的常用工具.将定量(一般为0.1mL)菌悬液置于平板表面涂布均匀的操作过程时需要用玻璃刮铲完成.用一段长约30cm,直径56mm的玻璃棒,在喷灯火焰上把一端弯成了形或倒形,并使柄与端的平面呈30o左右的角度(图4-5).玻璃刮铲接触平板的一侧,要求平直光滑.使之即能进行均匀涂布,又不会刮伤平板的琼脂表面.移液管吸管的准备:无菌操作接种用的移液管常为1mL或10mL刻度

15、吸管.吸管在使用前应进行包裹灭菌四、接种方法：斜面接种技术斜面接种是从已生长好微生物的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜空白斜面培养基上的一种接种方法.具体操作如下:贴标签:接种前在试管上贴标签,注明菌名,接种日期,接种入姓名等.贴在距试管口约23cm的位置.也可用记号笔注明上述内容.点燃酒精灯.接种:用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上.接种操作必须按无菌操作法进行,技术要点如下.手持试管:将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其它四指握在左手中,使中指位于两试管之间部位.斜面面向操作者,并使它们位于水平位置(图4-7).旋松管塞:先用右手松动棉塞或塑料管盖,以便接种时拔出.取接种环

16、:右手拿接种环,如握钢笔一样,在火焰上将环端灼烧灭菌,然后将有可能伸入试管的其余部分灼烧灭菌,重复操作12次.拔管塞:用右手指的无名指,小指和手掌边,先后取下菌种管和待接种试管的管塞,试管口缓缓过火灭菌,切勿烧得过烫.见图4-9(a)所示试管口缓缓过火灭菌.接种环冷却:将灼烧过的接种环伸入菌种管,先使环接触没有长菌的培养基部分,使其冷却.取菌:待接种环冷却后,轻轻沾取少量菌体或孢子,然后将接种环移出菌种管,注意不要使接种环的部分碰到管壁,取出后不可使种环通过火焰.见图4-9(b)所示.接种:在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管.从斜面培养基的底部向上部作Z形来回密集划线,切勿划

17、破培养基.也可用接种针在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种,直线接种可观察不同菌种的生长特点.见图4-8所示.塞管塞:取出接种环,灼烧试管口,并在火焰旁将管塞旋上.塞棉塞时,不要用试管去迎棉塞,以免试管在移动时纳入不洁空气.将接种环灼烧灭菌,放下接种环,再将棉花塞旋紧.液体接种技术是由斜面菌种或液体菌种接种到液体培养基中的一种方法.用斜面菌种接种液体培养基时,有下面两种情况:如接种量小,可用接种环取少量菌体移入培养基容器(试管或三角瓶等)中,将接种环在液体表面振荡或在器壁上轻轻摩擦把菌苔散开,抽出接种环,塞好棉塞,再将液体摇动,菌体即均匀分布在液体中.如接种量大,可先在斜面菌种管中注入定量无

18、菌水,用接种环把菌苔刮下研开,再把菌悬液倒入培养基中,倒前需将试管口在火焰上灭菌.用液体培养物接种液体培养基时,此时不能用接种环,而须用无菌的吸管,移液管或移液枪.先将移液管的包裹纸稍微松动,在离管口2/3长度处截开,加橡皮头,拔出移液管,伸入菌种管内,吸取菌液,转接到待接的培养基内,整个操作过程须在火焰上方或火焰旁进行.转接完成后灼烧管口并立即塞好管口.用过的移液管插入原包装移液管的纸套内,为什么要这样做 平板接种技术平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上,或用移液管,滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上,然后进行培养.其目的是进行菌落形态观察,分离纯化菌种,活菌计数,或进行其它试验.其方

19、法有多种,根据实验的目的要求不同,可分以下几种.斜面菌种接至平板划线法:按无菌操作的方法自斜面用接种环直接取少量菌体,在平板培养基表面自左至右轻轻连续划线或分区划线,注意不要划破培养基.或先制成菌悬液,接种在平板边缘的一处,将接种环灼烧灭菌,再从有菌的部位如上方法划线接种.点接法:一般用于霉菌菌落观察的接种.无菌操作下,用接种针从斜面或孢子悬液中取少量孢子,轻轻点接在平板培养基上,点接的部位和点接的次数根据实验目的与要求确定.菌悬液接至平板涂抹法:用灭菌的移液管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板上,然后用无菌的玻璃涂棒将菌液均匀涂布在整个平板上.混菌法:先将菌液加入培养皿中,然后加入融化并冷却至

20、4550的固体培养基,轻轻摇匀,平置,待完全凝固后倒置培养.平板菌种接至斜面此法一般是将分离培养得到的单菌落,在无菌操作下分别接种到斜面培养基上,以便进一步扩大培养或作保存之用.接种之前先选好平板上的单菌落,并做好标记.左手拿平板,右手拿接种环,在火焰上方或火焰旁边操作,灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却,以免将菌种烫死,然后挑取菌落,在火焰旁边稍等片刻,此时左手将平板放下,拿起斜面培养基,按斜面接种的方法接种.其它平板接种方法有时根据实验的目的要求不同,可采取不同的接种方法.如做抗菌谱试验时,可用接种环取菌在平板上与抗生素划垂直线;做噬菌体裂解试验时,可在平板上将菌液与噬菌体悬液混合涂布

21、于同一区域内,然后培养,等等.穿刺接种技术穿刺接种是用来接种厌氧菌,检查细菌的运动能力,或保藏菌种的一种接种方法.该技术是用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体,并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中.它只适宜于细菌和酵母菌的接种培养.具体操作如下.贴标签;点燃酒精灯;穿刺接种.其方法如下.手持试管;旋松棉塞;右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌,接着把在穿刺中可能伸入试管的其它部位,也灼烧灭菌.用右手的小指和手掌边拔出棉塞.接种针先在培养基部分冷却,再用接种针的针尖沾到少量菌种.接种有两种手持操作法.一种是水平法,它类似于斜面接种法;span另一种是垂直法,如图4-10所示.尽管穿刺时手持方法不同,

22、但穿刺时所用接种针都必须挺直,将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中.穿刺时要做到手稳,动作轻巧快速,并且要将接种针穿刺到接近试管的底部,然后沿着接种线将针拔出.最后,塞上棉塞,再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉.将接种过的试管直立于试管架上,放在37或28恒温箱中培养.24h 后观察结果.注意:若具有运动能力的细菌,它能沿着接种线向外运动而弥散,故形成的穿刺线较粗而散,反之则细而密.实验四 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数一、实验目的：了解稀释平板测数的原理,掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法的操作技术,进一步学习并辨别细菌,放线菌和霉菌的菌落特征;学习并掌握用稀释平板分离法分离土壤中的好气

23、性细菌,放线菌,真菌;学习用划线法分离微生物的方法.二、实验原理稀释平板测数法是根据微生物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌落这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个活的单细胞.计数时,首先将待测样品制成一系列稀释液,再取一定稀释度,一定体积的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内.经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,根据稀释倍数即可计算出样品中的含菌数.由于此计数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数.一般用于某些产品检定,如根瘤菌剂等产品检定,生物制品检验,土壤中可培养微生物含菌量测定及食品,水源的污染程度的检验等方面.自然条件

24、下,微生物常以群落状态存在,这种群落往往是不同种类微生物的混合体.为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物,必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养,这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化.在自然界中,土壤是微生物生活的良好环境,其中生活的微生物数量和种类极其丰富的,因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地.土壤中的微生物数量,种类与土壤肥力有关,肥沃的土壤中多,贫瘠土壤中少.其生理类群则与土壤的其它理化性质,如通气,pH有关,例如在通气良好的菜园土中,好气性微生物占有绝对优势.本实验以肥沃菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌,放线菌以及真菌,并进行数量测定.分离微生物常用的方

25、法有稀释平板分离法和划线分离法,根据不同的材料,可以采用不同方法,其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落,必要时再对单个菌落进一步分离纯化.在用稀释平板分离微生物时,往往采用选择性培养基进行分离,还可以同时测定待分离的微生物的数量.本实验分离细菌时采用加有制霉菌素或放线菌酮的牛肉膏蛋白胨培养基;分离放线菌时采用加有石炭酸和制霉菌素的高氏一号琼脂培养基;分离真菌时采用加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基.三、实验材料1,培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基;高氏一号琼脂培养基;加有氯霉素(或庆大霉素)和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基:在1000mL培养基中加入注射用氯霉素2mL,孟

26、加拉红33.4mg,均于灭菌前加入.2,材料:肥沃茶园土.四、实验用品内装1520个玻璃珠的90mL无菌水,9mL无菌水,直径9cm的无菌平皿,1mL无菌吸管,称样瓶,记号笔,玻璃刮铲,经2mm土壤筛过筛的菜园土,天平,试管架,无菌称量纸,酒精灯,火柴,接种环.五、实验方法 (一)稀释平板测数法1,取土壤样品 取表层以下510cm处的土壤样品,放入灭菌的袋中备用,或放在4冰箱中暂存.样品稀释液的制备准确称取待测样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置2030s,即成10-1稀释液;再用1mL无菌吸管,吸取10-1

27、稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管,吸取10-2稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,也吹吸3次,即成10-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9等一系列稀释菌液(图5-1).用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定.样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低.通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7,10-8,10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4,10-5,10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用10-3,10-4,10-5稀释度,测定真

28、菌数量时,采用10-2,10-3,10-4稀释度.3,平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.混合平板培养法将无菌平板编上10-7,10-8,10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取110-9稀释液各1mL放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各1mL放入编号110-8的3个平板中,再吸取110-7稀释液各1mL放入编号110-7的3个平板中,由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换.然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至4550的细菌培养基(图5-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,在30下培养.至菌落长出后即可计

29、数.涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀(图24-3),每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上2030min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至菌落长出后即可计数.计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数.(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.(2

30、)细菌,放线菌,酵母菌以每皿30300个菌落为宜,霉菌以每皿10100个菌落为宜.你能解释原因吗 选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算.混合平板计数法:每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数涂抹平板计数法:每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数10稀释倍数(二)土壤中好气性细菌的分离与计数1,土壤稀释液的制备按稀释平板测数法的相同步骤进行,按无菌操作法将土壤稀释至10-6即可.分离方法可以用三种方法进行分离.混菌法:按稀释平板测数法中的混合平板培养法进行,使用的稀释度为10-4,10-5,10-6三个,各做3个重复.涂抹法:按稀释平板测

31、数法中的涂抹平板测数法进行,使用的稀释度为10-3,10-4,10-5三个,各做3个重复.以上两法又统称为稀释平板分离法,可同时用于所分离菌的计数.划线法:用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线(图5-4).划线可按以下两种方式进行,一种为交叉划线法,是在平板的一边做第一次Z字形划线.转动培养皿70角,将接种环在火上烧过并冷却后,通过第一次划线部分,做第二次Z字形划线.同法进行第三次,第四次划线.另一种为边疆划线法,是从平板边缘的一点开始,连续作紧密的波浪式划线,直至平板中央.转动培养皿180,再从平板另一边(不烧接种环)同样划线至平板中央.划线法实质上属于一种由点到线的稀

32、释法,较适用于含菌比较单一的材料的纯化,对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用.以上各种分离法,都应按无菌操作进行.所用的培养基若在倒平板前,按50 g/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮(起抑制霉菌的作用),效果会更好.3,培养将上述接种过土壤悬液的平板倒置,于2830培养,至长出菌落为止(2436h).4,挑菌纯化在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面,同时作涂片检查,若发现不纯,应挑取此菌落做进一步划线分离,或制成菌悬液再做稀释分离,直至获得纯培养体.5,计数选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30300的平板,分别按稀释平板测数法中的混合平板测数法和涂抹平板测数法中的

33、公式计数.这样求得的是每克原始土样中的活菌数,若要折算为每克干土的含菌数,还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量).注:土壤含水量的测定是将一定质量的土壤在105110下烘干至恒重,再称干重.(三),土壤中放线菌的分离与计数土壤稀释液的制备按实验稀释平板计数法中的方法进行,将菜园土稀释至10-5.在稀释时,可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50g/m L 的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长.分离方法采用稀释平板分离法,又可分为两种方法.混菌法:按稀释平板计数法中的混合平板培养法进行,所不同者是稀释度,应采用10-3,10-4,10-5三个稀释

34、度,各做3个重复.涂抹法:按稀释平板计数法中的涂抹平板计数法进行,采用10-2,10-3,10-4三个稀释度,各做3个重复.培养将上述接种过土壤悬液的平板倒置于2830培养45d.挑菌纯化从平板中选择分离较好的放线菌菌落(应与细菌菌落区别开)较接斜面,并制片作纯度检查,若不纯,应进一步将该菌作稀释平板分离或划线分离,直至获得纯培养.(四),土壤中真菌的分离纯化与计数土壤稀释液的制备按实验稀释平板计数法中的方法进行,将土样稀释至10-4.分离方法采用稀释平板分离法.又可分为两种方法.混菌法:按稀释平板计数法中的混合平板培养法进行,所不同的是稀释度,应选10-2,10-3,10-4三个稀释度进行接

35、种.涂抹法:按稀释平板计数法中的涂抹平板计数法进行,所不同的是稀释度,应选10-1,10-2,10-3三个稀释度进行接种.培养将上述接种土壤悬液的平板倒置于28培养35d.挑菌纯化从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落(包括酵母菌菌落)转接至斜面,并同时制片作纯度检查.若不纯,应进一步挑取该菌落采用划线分离,或制成菌悬液进一步作稀释分离,直至获得纯培养体为止.计数选取每皿菌落数在10100之间的平板用于计数.不应遗漏酵母菌的菌落,必要时可制片检查,以免误为细菌菌落,具体方法见土壤中好气性细菌的分离与计数.菌种保存将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养,待长好后,置于冰籍中保存,必要时进行深入研究

36、.微生物微生物(microorganism简称microbe是包括细菌、病毒、 真菌 以及一些小型的 原生动物 、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 微生物的定义现代定义：微生物是一切肉眼看不见货看不清的微小生物的总称。形体微小，结构简单，通常要用 光学显微镜 和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。 （但有些微生物是可以看见的，像属于真菌的蘑菇、 灵芝 等。）1 特点： 个体微小,一般0.1mm。构造简单,有单细胞的,简单多细胞的,非细胞的。进化地位低。2 分类： 原核类: 三菌,

37、三体。三菌：细菌、蓝细菌、放线菌 三体：支原体、衣原体、立克次氏体。真核类: 真菌,原生动物,显微藻类。非细胞类: 病毒, 亚病毒 ( 类病毒,拟病毒,朊病毒)。3 五大共性：体积小,面积大；吸收多,转化快 ；生长旺,繁殖快；适应强,易变异；分布广,种类多微生物的类群种类原核：细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。真核：真菌、藻类、原生动物。 非细胞类：病毒和亚病毒。一般地，在中国大陆地区的教科书中，均将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、 放线菌 、 立克次体 、 支原体 、 衣原体 、 螺旋体 。1 细菌:(1)定义:一类细胞细短,结构简单,胞壁坚韧,多以二分裂方式繁殖和

38、水生性强的原核生物(2)分布:温暖,潮湿和富含 有机质 的地方(3)结构:主要是单细胞的原核生物,有球形,杆形,螺旋形基本结构：细胞膜 细胞壁 细胞质 核质。特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞 (4)繁殖: 主要以二分裂方式进行繁殖的 (5)菌落: 单个细菌用肉眼是看不见的,当单个或少数细菌在 固体培养基 啊行大量繁殖时,便会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞 群落 .菌落是菌种鉴定的重要依据.不同种类的 细菌菌落 的大小,形状光泽度颜色硬度透明度都不同. 2 放线菌(1)定义:一类主要成菌丝状生长和以 孢子 繁殖的陆生性较强的原核生物(2)分布:含水量较低,有机物较丰富的,呈微碱性的

39、 土壤 中 (3)形态构造:主要由菌丝组成,包括基内菌丝和气生菌丝(部分气生菌丝可以成熟分化为孢子丝,产生孢子) (4)繁殖:通过形成无性孢子的形式进行无性繁殖(5)菌落:在固体培养基上:干燥,不透明,表面呈致密的丝绒状,彩色干粉真菌真菌（Fungus）是一种真核生物。最常见的真菌是各类 蕈类 ，另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入动物或植物，现在成为自己的界，分为四门真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和 蕈菌 （大型真菌），它们归属于不同的亚门。真菌的细胞既不含 叶绿体 ，也没有 质体 ，是典型异养生物。它们从动物、植物的活体、死

40、体和它们的排泄物，以及断枝、落叶和土壤 腐殖质 中、来吸收和分解其中的有机物，作为自己的营养。真菌的异养方式有 寄生 和 腐生 。真菌常为丝状和多细胞的有机体，其营养体除大型菌外，分化很小。高等大型菌有定型的 子实体 。除少数例外，真菌都有明显的细胞壁，通常不能运动，以 孢子 的方式进行繁殖。真菌菌落：大小：大。形状：绒毛状，絮状，蛛网状。颜色：五颜六色（孢子的颜色）真菌：念球菌、粘菌等。 细菌的菌落特征与繁殖细菌在固体培养基上分裂繁殖时，许多细胞堆集在一起，形成肉眼可见的群体称为菌落。不同种类的细菌其菌落形态互不相同，表现在大小、形状、边缘、隆起、光泽、质地和颜色等方面。细菌菌落大小不一，小

41、的不到1毫米，大的可以铺满整个培养皿；菌落形状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等；菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等；有的菌落有光泽、有的没有；有的菌落较粘，有的则较脆；菌落一般呈灰色，少数为白色、黄色、红色、绿色和棕色等。大小：小。形状：光滑，粘稠或粗糙干燥。颜色：多为白色。细菌一般进行无性繁殖，表现为细胞的横分裂，称为裂殖。裂殖结果形成两个大小相同的子细胞。在最适宜的条件下，2030分钟就能分裂1次，并可继续分裂若干次。当继续分裂时，常因养料供应不足或温度变化以及其它种种原因而停止分裂或死亡。放线菌的菌落特征与繁殖放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内

42、菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。孢子丝形成孢子的方式有凝聚分裂和横隔分裂两种。大多数放线菌按凝聚分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝内从顶端到基部，细胞质分段围绕核质，逐渐凝聚成一串大小相似的小段，然后每一小段外面产生新的孢子壁而形成孢子，最后孢子丝壁破裂，将孢子释放出来。少数放线菌按横隔分裂方式形成孢子，其过程是在孢子丝内产生许多距离均等的横隔，然后在横隔处断裂形成孢子。另外有些放线菌可在菌丝上形成孢子囊，在孢子囊内形成孢囊孢子，但这样的种类很少。：