全国结核病耐药性基线调查报告

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1、全国结核病耐药性基线调查报告篇一：124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析 梁亚萍11赵丽丽2高漫1摘要：目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基 因的突变特征进行分析。方法 对124例耐多药结核分枝杆 菌和50株敏感株的耐药相关基因(异烟肼inhA、katG和 oxyR-ahpC间隔区;利福平rpoB )进行序列测定，分析其基 因突变情况。结果异烟肼耐药inhA基因突变率为; katG 基因突变率为 (87/124)，主要位于315位；oxyR-ahpC间 隔区突变率为 ； inhA. katG两种基因同时突变率%，三种 基因同时考虑突变率。利福平

2、rpoB基因突变的检出率高 达%，突变主要发生在531、526、516位点。结论 我省耐 多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为katG 315、inhA C-T (T5)、axyR-ahpC 间隔区 C-T，利福平为 rpoB531、 526、516。结合MDR-TB耐药相关基因的特征分析，可以建 立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核耐多药性 的新方法。关键词：结核分枝杆菌 耐多药 基因测序 突变Analysis of charac teris tics of gene tic mutation of 124 cases ofmultidrug-resistant mycobacter

3、ium tuberculosisLiang YapingllZhao Lili2Gao ManiAbstractObjective: To analyze the mutation characteristics of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis related :Resistant genes of 124 cases of multidrug-resistant mycobacterium tuberculosis and 50 sens itive st rains were given sequence det ermi

4、na tion to analyze the gene :Gene mutation rate of inhA was %; gene mutation rate of KatG was % ,mainly in the 315;gene mutation rate of oxyR-ahpC spacer was %;mutation rate of inhA, katG at the same time was %,mutation rate of the three genes at the same time was %.Gene mutation rate of rpoB of rif

5、ampicin was %,and mutation occurred mainly in the 531,526,516 :The most xxmon mutation of multidrug-resistant isoniazid genes in our province were katG 315, inhA C-T ,oxyR-ahpC spacer C-T,and the rifampicin were rpoB531,526, analysis of xxbining the feature of MDR-TB resistance related gene can esta

6、blish a rapid, accura te, specific and suit able new met hod to detect multidrug-resistant tuberculosis.Keywords:Mycobacteriumtuberculosis;Multi drug-resistant;Genesequencing;Mutation【中图分类号】：R52【文献标识码】：【文章编号】： 我国的耐药结核病流行情况较为严重，是全球27个耐 药结核高负担国家之一，据全国结核病耐药基线调查结果显 示1：我国肺结核病患者中耐多药结核（MDR-TB，指结核 分枝杆菌同时对异1

7、基金项目：陕西省卫生科研项目（）作者简介：梁亚萍，女，本科，副主任检验师，主要从 事结核病实验室诊断相关工作烟肼、利福平耐药）耐药率为。我省是结核病的重灾 区，耐多药率高达2,MDR-TB的增多严重影响了结核病的 化疗效果，使患者治疗费用高治愈率低，死亡率高，已成为 我省结核病控制的难题。结核分枝杆菌耐药通常与某些基因 突变有关，但不同地区的耐药相关基因突变特征有所不同。 本研究对我院来自我省各地的结核患者124株耐多药结核分 支杆菌进行了耐多药相关基因测序，异烟肼耐药相关基因 inhA、katG和axyR-ahpC,利福平耐药基因ropB，分析我省 耐多药基因的突变特征，从而建立一种快速、准

8、确、特异的 适合于我省的检测结核耐多药的新方法。1材料和方法标本：本研究菌株是收集本院20XX年8月-20XX年2 月来自于我省陕北、陕南以及关中结核患者的174株结核分 枝杆菌临床分离株，其中124株耐多药菌株和50株敏感菌 株。药敏试验:采用美国BD公司的BACTEC MGIT 960行利 福平、异烟肼快速药敏实验，药物浓度及操作过程严格按照 MGITTM Procedure Manual 要求进行3。DNA模板的制备：采用CTAB法4提取结核分枝杆菌 DNA。PCR扩增及序列测定：聚合酶链反应（PCR）引物序列 见表1,采用50ul反应体系。反应参数：95C预变性5min； 95C 变性

9、40s, 64C退火40s, 72C延伸1min,35个循环， 然后72C延伸7min。PCR扩增产物经%琼脂糖电泳后送北京 擎科生物技术有限公司测序。表反应引物及目标片段位置基因引物名称引物序列（5 -3）位置片段大小 （bp）inhA inh A-F TGC CCA GAA AGG GAT CCG TCA TC 16732781673732 455inh A-R ATC AGG AAT GCG TCC GCG GAkatG kat G-F AAC GAC GTC GAA ACA GCG GC21548862155340 455kat G-R GCG AAC TCG TCG GCC AAT

10、TCoxyR-ahpCoxyR-ahpC-F GAG ACC GGC TTC CGA CCA CC27259432726235 293oxyR-ahpC-R GCT GGT AGG CGG GGA ATT GATrpoB rpoB-F CTT GCA CGA GGG TCA GAC CA760829761371543rpoB-R ATC TCG TCG CTA ACC ACG CCPCR序列分析：以H37RV作阴性对照，使用个性化perl 脚本对序列结果进行对比分析。2结果异烟肼主要耐药相关基因突变分析异烟肼耐药机制 较为复杂，对异烟肼耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC 间隔区

11、检测后显示，在124株耐多药菌株中18株inhA基因 突变，主要发生在启动子区，其中12株发生C-T(-15)突 变,4株 发生T-C (-8)突变和2株其他区突变，这些菌中 还有12株联合katG突变；87株发生了 katG基因突变，均 为单个点突变，其中82株为katG315突变，5株联合了 oxyR-ahpC间隔区的突变； 19株axyR-ahpC间隔区发生的突变，主要发生在C-T有6 株,还有一些其他突变，5株联合katG突变。利福平主要耐药相关基因突变分析利福平耐药分子 机制比较明确，主要由rpoB基因突变引起，本实验扩增了 543bp相关片段,包含了 81bp耐药决定区，即密码子5

12、07-533 Ko 124株耐多药菌中，118株发生了 rpoB基因突变，其 中99株为点突变，19株联合突变，这些突变位点主要位于 利福平耐药决定区，最多的是531位点突变62株，其次 526 位突变29株，516位点为14株。另外50株敏感菌在异烟肼、 利福平扩增区未检出突变。3讨论利福平、异烟肼是抗结核一线主要药物，在结核病的治 疗中起着重要作用，MDR-TB是当今结核病化疗失败的重要因 素之一，并被广泛重视，耐多药结核病的控制关键在于早期 选择敏感药物联合治疗5。目前用BACTEC MGIT 960检测 结核菌药物敏感性，前提是培养阳性才能进行药敏实验，总 共需花费23天左右时间6,临

13、床医生对于没有药敏结果的 这种病例，只能通过经验用药，难以满足临床需要，所以一 种快速、简便的耐多药检测方法对于病人的及时有效的治疗 极为重要。已有研究表明7-9,利福平和异烟肼耐药性的产 生主要与rpo B、kat G、inh A基因的突变有关，但由于结 核分枝杆菌在生长过程中受到各种因素的影响，在不同地区 其突变类型和频率还是存在差异性。研究我省主要基因突变 发生的特征，可为今后建立敏感、快速和特异的耐药诊断技 术提供理论基础。其中异烟肼耐药机制相对较为复杂，本次研究对异烟肼 耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC间隔区的分子特征进行分析，结果显示：124 例耐多药菌中inhA

14、基因突变的检出率为 (18/124)； katG 基因突变率为 (87/124)，而且katG基因突变高度集中， 主要位于315位点，占katG基因突变的 (82/87),315位点 密码子由AGC突变成ACC，丝氨酸变为苏氨酸，；oxyR-ahpC 间隔区突变率为 (19/124)。inhA、katG两种基因突变同 时检出率(93/124)，三种基因检出率(107/124)，这 与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所国家重点实验 室报道基本一致10。利福平耐约主要由rpoB基因突变引起，本院124例利 福平耐药的菌株中，118株发生突变，rpoB基因突变的检出 率高达 (118/124)。1

15、18例耐药菌中，突变主要发生在rpoB 531检出率%,531位密码子由TCG突变为TTG,丝氨酸变为亮 氨酸；rpoB 526 检出率 % ( 29/118 ) ; rpoB 516 检出率 (14/118)位点，rpoB531、526、516 占全部 rpoB 基因突11-13变的 (105/118)，这与陈燕、Yuan X及国外 学者报道一致，说明通过检测rpoB基因突变来检测利福平结核分枝杆菌耐药的可靠性很高，另外 还有6株未检测出rpoB突变的耐药菌，可能是其他基因突 变引起。通过对我省MDR-TB耐药相关基因的特征分析，说明异 烟肼oxyR-ahpC间隔区突变在我省耐多药菌中也较常

16、见，增 加oxyR-ahpC间隔区的检测，可提高基因突变的检出率，仅 考虑inhA、katG两个基因会对MDR-TB漏检，影响耐多药 患者治疗。综上所述，对异烟肼从katG 315、inhA C-T (-15)、 axyR-ahpC间隔区C-T这三个基因，利福平的rpoB531、526、 516考虑建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测耐 多药结核的分子生物学技术，对我省医疗卫生技术的进步以 及结核病的控制具有积极促进作用和意义。参考文献1 中华人民共和国(20XX-20XX) R北京：人民卫 生出版社，20XX.2 邹远妩，王婷，杨莉，等.431例复治患者结核分枝 杆菌对一线抗结核病药物

17、耐药分J 临床肺科杂志，20XX, 19:17291730.3 梁亚萍，高漫.BACTEC MGIT 960用于结核分枝杆菌 快速培养的初步评价J中国预防医学杂志，20XX,12(6) :521-522.4 Somerville W,Thiber t L,Schwar tzman K,e t of Mycobacterium tuberculosis DNA:a question of con tainmen t J.J Clin Microbiol,20XX,43:29962997.5 邓海清，陈保文，杨蕾，等.结核病药效评价用结核 分枝杆菌参考菌株的筛选J中国生物制品学杂 志，20XX,2

18、8:160-1666 张娟，蒋俊，张红.MGIT960与罗氏培养法在结核分 枝杆菌培养及药敏试验中的比对分析J 中国防痨杂志， 20XX,33 (06) :361364.7 Zhang Z,Lu J,Wang Y. Prevalence and molecular characterizationof fluoroquinoloneresistantMycobacteriumtuberculosisisolatesinChinaJ .ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,20XX,58:127T30.8 Campbell PJ ,Morlock GP ,Sike

19、s RD ,et detection of mutations accociated with first-and second-line drug resistance xxpared with conventional drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosisJ.Antimicrob Agents Ch,:2032-2041.9 孙明洁，张江峰，张亚丽，等结核分枝杆菌利福平耐 药株rpoB基因突变特征研究J中华医院感染学杂 志，20XX,:5201-5203 10 Luo T,Zhao M,Li X,e t of m

20、utations to detectmultidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrainsinShanghai,ChinaJ.AntimicrobAgentsCh,20XX,54: 1075-1081.11 陈燕，赵丽丽，孙庆等耐多药结核分枝杆菌耐药 相关基因突变特征分析J.疾病监测，20XX,29(4) :307-309.12 Yuan X, Zhang T, Kawakami K, et al. Molecularcharacterizationofmultidrug-andextensivelydrug-resistant Mycobact

21、erium tuberculosis strains in Jiangxi, ChinaJ. J Clin Microbiol, 20XX,50:2404-2413.13 Engs trom A ,Morcillo N, Imperiale B,e t of first-and second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by pyrosequencingJ.J Clin Microbiol,20XX,50: 2026-2033.篇二：噬菌体法检测结核分枝杆菌及其耐药性的研究 龙源期刊网噬菌体法检测结核分枝杆菌及其耐药性的研究