中国药科大学-色谱分析法概论(胡育筑)

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1、色谱分析法概论,分析化学教研室,色谱分析法概论,1. 概 述,2. 色谱过程和术语,3. 色谱法发展趋势,概 述,1.色谱法（chromatography),M.Tswett,试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,概 述,定义：,概 述,分离基础：,差 速 迁 移,概 述,色谱法特点：,概 述,概 述,2.色谱法分类,分类方法：（1） 以两相所处的状态分类,气相色谱：流动相为气体（称为载气） GC 按固定相不同分为：气固色谱 (GSC) 气液色谱

2、 (GLC),液相色谱：流动相为液体，也称为洗脱液或淋洗液。 按固定相的不同分为：液固色谱(LSC)和液液色谱(LLC)。,概 述,（1） 以两相所处的状态分类,(2)按操作形式 柱色谱、 平板色谱 柱色谱,液-固吸附柱色谱法, 平板色谱法（薄层色谱、纸色谱）,概 述,柱色谱( Column chromatography ): HPLC, GC etc.,平板色谱 ( Planar chromatography ): TLC, PC,概 述,(3)按分离机理,(3)按分离机理 吸附色谱法 （absorption chromatography） 分配色谱法 （partition chromato

3、graphy） 离子交换色谱法 （ion exchange chromatography ） 空间排阻色谱法（又称 分子排阻色谱法） （size exclusion chromatography）,GLC 填充柱色谱法 气相色谱法 GSC (GC) 毛细管柱色谱法 经典液相柱色谱法 LLC 柱色谱法 （LC） LSC 色谱法 IEC 高效液相色谱法 SEC (HPLC) LSC 薄层色谱法 (TLC) LLC 液相色谱法 平板色谱 SEC (LC) 纸色谱法 （PC） 毛细管电泳法 (CE) 超临界流体色谱法 (SFC),2. 色谱过程和术语,2.1 色谱过程,物质分子在相对运动的两相间，分配

4、“平衡”的过程。 其分离机制是差速迁移。,例：顺反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸附,2. 2 基本术语,1. 色谱, 基线（base line）：仅有流动相通过检测器系统时产生的信号的曲线。如图Ot 线 峰高（h）：色谱峰顶点与基线之间的距离。如图BA线, 峰宽 标准差（）：两拐点间距离之半。 峰宽（peak width, W 或Y）：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距。如图 IJ 间的距离,色谱过程和术语,半峰宽（peak width at half height, W1/2 或Y1/2 ）： 峰高一半处的峰宽。如图GH间的距离,2. 保留值 试样中各组分在固定相内的滞留状态，是主要的

5、色谱定性参数。 保留值通过实验测定，用时间或相应的流动相体积表示，称为保留时间和保留体积。 保留时间 tR （min） 保留体积 VR （mL）,色谱过程和术语,2. 保留值 保留时间（retention time, tR )： 从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔,色谱过程和术语, 死时间（dead time, t0 or TM)： 不被固定相滞留的组分（流动相）从进样开始、通过色谱柱，到出现最大值所需要的时间。,色谱过程和术语,调整保留时间（adjusted retention time, tR ) 组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留的时间,色谱过程和术语,2. 保留值

6、,死体积（dead volume, V0 ) 由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积,死体积大，色谱峰扩张，柱效降低,调整保留体积（adjusted retention volume, VR ) 由保留体积扣除死体积后的体积,调整保留体积VR：保留体积与死体积之差， 其本质为组分停留在固定相时所消耗流动相的体积,与流动相流速无关 和tR 同属于色谱定性参数,即： VR 是定值， tR 与FC成反比,V0 和 Vm、t0 和 tm 的区别,由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积称为V0 ； 固定相充满死体积所需的时间 为t0 。 平衡时流动相在色谱柱中占有的体积用Vm表示，经

7、过色谱柱所需时间用tm 表示。 物理意义有区别 Vm V0，tm t0 。 在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔容的容积，视为近似相等。,：指将待测物的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为(已知范围内组分的定性参数)。,Ix: 待测组分的保留指数，z与z+n为一对正构烷烃的含C数，一般n为1。tR(X) 应介于t R(Z)和 t R(Z+n)之间。,保留指数Ix：,色谱过程和术语,分配系数(partition coefficient，K ),平衡时组分在固定相与流动相中的浓度比 与温度有关,3. 分配系数和容量因子,色谱过程和术语,色谱过程和术语,容量因子（capacity factor，k

8、 ),平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量之比,k 值与组分、固定相和流动相的性质及温度、压力等有关, 容量因子k与分配系数K的线性关系,容量因子k 的计算,组分容量因子大， 保留时间长 定性参数,组分保留时间不等， 容量因子也不等 分离基础,色谱过程和术语,k 与 tR 关系,色谱过程和术语,4. 分离参数,分离因子 （分配系数比、选择性系数）,分离度（resolution, Rs ),色谱过程和术语,分离度（resolution, Rs ),R = 1.0 基线分离,R = 1.5 完全分离,例1 一个气相色谱柱，由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得Vs=14.1mL,载气流速为

9、43.75mL/min。分离一个含A、B、C三组分的样品，测得组分保留时间组分A为1.41min、组分B为2.67min、组分C为4.18min、空气为0.24min。 试计算： （1）死体积（假定检测器及柱接头等体积可忽略） （2）各组分的调整保留时间和分配系数 （3）相邻组分的分配系数比,色谱过程和术语,解：,色谱过程和术语,检测器及柱头等体积可忽略时 Vm V0,所以：,色谱过程和术语,相邻峰分配系数比为：,3. 色谱分离的基本理论3.1 分配系数与保留行为的关系,在色谱柱 (或板) 一定时，Vs与Vm一定； 若流速、温度也一定，t0一定, tR仅取决于分配系数K，K大的组分tR长。 在

10、实验条件一定时，tR取决于组分性质 定性指标。,色谱过程方程,例：某色谱柱的Vs=1.3 mL、V0=2.1 mL，分离A、B 两物质KA=10.0、KB=40.0。试计算A、B的保留 体积。 解：设V0=Vm，则VR=V0(1+KVs/Vm)=V0+KVs， 可得：VR(A)=15.1 mL VR(A)B =54.1 mL,3.2 等温线 在一定条件下，组分在固定相和流动相间分配达到平衡时，在两相中的浓度cs和cm的比值K为常数，由此绘制出的cs和cm的关系曲线显然应为一条直线，被称为等温线。 线性等温线为正常峰 凸形等温线，产生拖尾峰； 凹形等温线，产生前延峰,等温线对其他色谱有指导意义,

11、线性等温线 a（理想） 对称峰 非线性等温线 凸形 b 拖尾峰 凹形 c 前沿峰,一般使用对称性因子(symmetry factor) 评价色谱峰的对称性。对称因子的计算式为,完全对称 (B=A) 峰的对称因子为1.00 。 对称因子为0.951.05之间的峰看成为正常峰 (对称); BA: T大于1.05的为拖尾峰。,中国药典2005年版: 拖尾因子,速率理论 - 动力学,等温线,塔板理论 - 热力学,色谱的基本原理,3. 3 塔板理论,最早由Martin等人提出，把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 引入理论塔板数 ( n ) 作为衡量柱效率的指标,（

12、1）在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡（H理论塔板高度） （2）载气非连续而是间歇式进入色谱柱，每次进气一个塔板体积 （3）样品和载气均加在第 0 号塔板上且忽略样品沿柱方向的纵向扩散 （4）分配系数在各塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关,四个基本假设 ( 把色谱柱看作一个分馏塔 ),设 理论塔板数 n 组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数 理论塔板高度 H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长,3.3 塔板理论,3.3 塔板理论,色谱峰 W 越小，n 就越大，而 H 就越小，柱效越高 n 和 H 是描述柱效的指标,3.3 塔板理论,由于死时间 t0 包括在 tR

13、 中，而实际的 t0 不参与柱内分配，所计算的 n 值大，H小，但与实际柱效能不同； 因此 常把 t0 扣除，采用有效理论塔板数 n有效 和有效塔板高 H有效评价柱效能。,塔板理论 优缺点,3.3 塔板理论,塔板理论的特点, 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,塔板理论的局限性,柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 塔板理论无法解释同一

14、色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,van Deemter 方程式,3.4 速率理论,塔板理论 优缺点,1.4.3 速率理论,3.4 速率理论,1956 年荷兰学者 van Deemter 等在研究气液色谱时提出 色谱过程 动力学理论 应用了塔板理论板高 H 的概念 充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素,van Deemter 方程的数学简化式为：,B / u 纵向扩散项,3.4 速率理论,式中 u 为流动相的线速度： A，B，C 为常数 A 涡流扩散系数； B 纵向扩散系数； C 传质阻抗系数,C

15、u 传质阻抗项,A 涡流扩散项,H,3.4 速率理论,C u 传质阻抗项,B / u 纵向扩散项,A 涡流扩散项,H,涡流扩散项（多径扩散项）：A,产生原因： 载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同 涡流扩散,3.4 速率理论,动画,影响因素：填充柱 （25mm） 固定相颗粒越小，填充越均匀，A 项越小,讨论：,空心毛细管柱（0.1 0.5 mm），A=0，较高 n,3.4 速率理论,纵向扩散项（分子扩散项）：B / u,产生原因： 组分在固定相中被流动相推动向前、展开 浓度梯度 谱带展宽,3.4 速率理论,动画,B/u 纵向扩散项：,由于流动相的扩散，溶质沿着柱长方向，存在着浓度

16、差， 产生纵向扩散, 又称分子扩散相, 导致色谱峰变宽， H (n)，分离变差。 B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 1 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）,讨论： 与填充物有关的因子（ 扩散阻碍因子 ） 空心柱 =1 填充柱 1 纵向扩散与 u 成反比 u 大，B /u 可忽略 u 小，不可忽略 Dg 组分在气相中的扩散系数 M载气 大，Dg 小，如：N2 M载气 小，Dg 大，如：H2 ，He,3.4 速率理论,影响因素：,讨论：,3.4 速率理论 纵向扩散项 B / u,分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散， 扩散系数：Dg 和（M载气）1/2 成反比,高

17、流速/低柱温/大 M载气,降低 纵向扩散,选用分子量较大的载气,选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选 M 较大的 N2 （粘度大） u 较大时，选 M 较小的 H2 ，He （粘度小）,3.4 速率理论 纵向扩散项 B / u,较低的柱温,控制较高线速度,产生原因： 样品在气液两相间分配，样品未及溶解就被带走，从而造成峰扩张,3.4 速率理论 传质阻抗项 Cu,传质阻抗系数,动画,讨论：,注：固定液应完全覆盖载体表面，不可以太薄，否则k太小，柱子寿命也短。,3.4 速率理论 传质阻抗项 Cu,影响因素：,3.4 速率理论 柱效与流速,H u 曲线与最佳流速： 流速对 B、C

18、 两项相反的作用，对柱效的总影响使得存在着最佳流速值。 以塔板高度 H 对应载气流速 u 作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,3.4 速率理论 柱效与流速,最佳流速 即式中H 对 u 的一阶导数的极小值,综合优化,1. 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 2. 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 3. 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 4. 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小

19、，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,3.4 速率理论 小 结,3.5 影响分离度的因素,3.5 影响分离度的因素,4. 基本类型色谱法的分离机制,4.1 吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。,吸附色谱示意图 X 溶质分子 Y 流动相分子 a 吸附剂 m 流动相,4.2 分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过

20、化学键将固定液结合在担体表面。,分配色谱示意图 流动相(m)中的溶质分子 溶解在固定液(s)中的分子,4.3 离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。,阳离子交换色谱示意图 R 树脂骨架 m 流动相 固定离子 可交换离子,4.4 分子(空间)排阻色谱（凝胶色谱） 以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶,凝胶色谱示意图 Ge 凝胶 m 流动相,5. 色谱法的发展趋势,发展趋势,小结,1. 色谱分析概论(定义、特点、分类)； 2. 色谱法的基本原理（色谱过程、各类 色谱法的分离机制、分配系数与保留 行为的关系）； 3. 色谱法的发展概况。,