第2章细胞培养2

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1、1细胞培养发展历史细胞培养发展历史1885年年 Wilhelm Roux 将鸡胚髓板在温热的盐水中维持存活将鸡胚髓板在温热的盐水中维持存活 若干天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。若干天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。1887年年 Amold 把桤木的木髓碎片接种到蛙皮下，当白细胞侵入把桤木的木髓碎片接种到蛙皮下，当白细胞侵入 到木髓碎片后，他将这些白细胞收集到盛有盐水的小碟到木髓碎片后，他将这些白细胞收集到盛有盐水的小碟 中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活一个短的时中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活一个短的时 间。间。1902年年 哈泊兰德哈泊兰德 预言植物细胞的全能性

2、预言植物细胞的全能性1903年年 Jolly 将蝾螈的白细胞保存在悬滴中并维持了将蝾螈的白细胞保存在悬滴中并维持了1个月。个月。1906年年 Beebe&Ewing 在动物的血液中尝试培养了传染狗淋巴肉在动物的血液中尝试培养了传染狗淋巴肉 瘤病毒的细胞。瘤病毒的细胞。219071907年年 Ross Harrison Ross Harrison（美国）（美国）将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这些组织在体外不但存活若干周，而且居然从细胞中这些组织在体外不但存活若干周，而且居然从细胞中长出了轴突（神经细胞）。长出了轴突（神经细胞）。意

3、义：公认的组织培养开始标志；意义：公认的组织培养开始标志；解决了轴突发生的争论；解决了轴突发生的争论；培养方法将培养物放在盖玻片上并培养方法将培养物放在盖玻片上并倒置于凹玻片腔中培养。倒置于凹玻片腔中培养。3 1923 Alexis Carrel(surgeon)Aseptic techniquesCarrel Flask1912-1946Culture Chicken Embryo FibroblastPlasma+tissue homogenate在没有抗生素的条件下，使鸡胚心脏细胞维持生存在没有抗生素的条件下，使鸡胚心脏细胞维持生存34年，先后传代年，先后传代3400次。次。419341

4、934年年 荷兰温特荷兰温特 发现生长素，并证实了对植物细胞发现生长素，并证实了对植物细胞 培养的作用培养的作用19371937年年 高特里特高特里特,诺比考特诺比考特(法法)几乎同时离体培养几乎同时离体培养 了胡萝卜组织，并使细胞增殖了胡萝卜组织，并使细胞增殖19401940年年 Earle Earle 建立了可无限传代的建立了可无限传代的C3HC3H小鼠的结缔组小鼠的结缔组 织细胞系织细胞系L L系（曾在体外经甲基胆蒽系（曾在体外经甲基胆蒽 转化）。转化）。19511951年年 Gay Gay 建立了人第一个细胞系人体宫颈癌建立了人第一个细胞系人体宫颈癌 HelaHela细胞系（原报道为鳞

5、癌，细胞系（原报道为鳞癌，19711971年更年更 正为腺癌）。正为腺癌）。5动物细胞的生长动物细胞的生长 动物细胞特性动物细胞特性:真核细胞基本结构：亚显微水平真核细胞基本结构：亚显微水平(0.2m)(0.2m)膜囊结构膜囊结构质膜，核膜，内膜系统质膜，核膜，内膜系统 纤维结构纤维结构染色质，细胞骨架系统染色质，细胞骨架系统 颗粒结构颗粒结构核糖体核糖体6细胞器的化学组分：细胞器的化学组分：有机分子：蛋白质类（结构蛋白，分泌蛋白，酶等）有机分子：蛋白质类（结构蛋白，分泌蛋白，酶等）脂类（磷脂，卵磷脂，脑磷脂，心磷脂）脂类（磷脂，卵磷脂，脑磷脂，心磷脂）多糖类（糖脂，糖蛋白等）多糖类（糖脂，糖

6、蛋白等）核酸类（核酸类（DNA,RNADNA,RNA等）等）固醇类（胆固醇等）固醇类（胆固醇等）无机分子：水（结合水，游离水）无机分子：水（结合水，游离水）无机离子（无机离子（NaNa+,K,K+,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+)7细胞质膜生物学特性：细胞质膜生物学特性：对水具有很强的通透性对水具有很强的通透性 对脂溶性物质的通透性大于非脂溶性物质对脂溶性物质的通透性大于非脂溶性物质 电阻率很高，一般在电阻率很高，一般在10109 910101111 表面张力较低表面张力较低8细胞膜下皮质层细胞膜下皮质层:微丝微丝(microfilament,MF)中等纤维中等纤维(intermedi

7、ate filament,IF)微管微管(microtubule,MT)9动物细胞之间的连接形式动物细胞之间的连接形式 紧密连接紧密连接(tight junction)(tight junction)间隙连接间隙连接(gap junction)(gap junction)隔壁连接隔壁连接(separate junction)(separate junction)无脊椎动物细胞无脊椎动物细胞 中间连接中间连接(intermediate junction)(intermediate junction)脊椎动物细胞脊椎动物细胞 桥粒连接桥粒连接(desmosome junction)(desmoso

8、me junction)10培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征1.贴壁型细胞贴壁型细胞2.悬浮型细胞悬浮型细胞上皮细胞型上皮细胞型成纤维细胞型成纤维细胞型游走细胞型游走细胞型多形性细胞多形性细胞11培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点1.贴附贴附 影响因素：离子（影响因素：离子（Ca2+)机械、物理因素（低温、培养液流动过快）机械、物理因素（低温、培养液流动过快）生物因素（生长因子）生物因素（生长因子）2.接触抑制接触抑制3.密度抑制密度抑制12培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖过程单个细胞的生长过程单个细胞的生长过程 细胞周期细胞周期 G1G1持续时间长短差异大持续时间长短差

9、异大 S S 时间较恒定，平均时间较恒定，平均6-8hr6-8hr G2 G2对环境敏感对环境敏感 M M 持续时间很短持续时间很短1314细胞系的生长过程细胞系的生长过程 细胞在培养中存活时间的长短，主要取决于细胞的种类、性细胞在培养中存活时间的长短，主要取决于细胞的种类、性状、和原供体的年龄等。状、和原供体的年龄等。三个生长阶段：三个生长阶段：原代培养期原代培养期从体内取出组织接种培养到第一次传代的从体内取出组织接种培养到第一次传代的 阶段，一般维持阶段，一般维持14周。周。传代期传代期 衰退期衰退期15每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程每代细胞一般经过三个生长阶段：每代细胞一般经过三个

10、生长阶段：潜伏期潜伏期 指数生长期指数生长期 停止期（平台期）停止期（平台期）16群体细胞的生长过程群体细胞的生长过程17潜伏期潜伏期(1atent phase)(1atent phase)18对数生长期对数生长期(logarithmic growth phase)(logarithmic growth phase)接触抑制接触抑制(contact inhibition)(contact inhibition)正常细胞会因为细胞接触而发生相正常细胞会因为细胞接触而发生相互抑制分裂和限制运动的现象。互抑制分裂和限制运动的现象。对数生长期对数生长期最具活力时期（细胞分裂旺盛，分最具活力时期（细胞分

11、裂旺盛，分 裂相增多。）裂相增多。）细胞分裂指数细胞分裂指数(mitotic index(mitotic index，MI)MI)MI MI(分裂相个数分裂相个数10001000个细胞个细胞)100100 19稳定期稳定期(stationary phase)培养空间和营养物质有限培养空间和营养物质有限 代谢废物积累代谢废物积累 新分裂细胞数新分裂细胞数=死亡细胞数死亡细胞数 （稳定期）（稳定期）注：细胞代谢活动仍在进行中注：细胞代谢活动仍在进行中20衰亡期衰亡期(senescence phase)21培养细胞的遗传学特征培养细胞的遗传学特征1.染色质与染色体染色质与染色体 原代培养多呈二倍体原

12、代培养多呈二倍体 长期传代发生偏离二倍体现象长期传代发生偏离二倍体现象2.细胞性别细胞性别 Barr小体小体 Y小体小体22体内外细胞的差异及培养细胞的分化体内外细胞的差异及培养细胞的分化 体内外细胞的差异体内外细胞的差异 培养细胞的分化培养细胞的分化23细胞培养液细胞培养液常用液体常用液体 1.1.水水2.2.平衡盐溶液平衡盐溶液3.3.消化液消化液4.4.消化酶抑制液消化酶抑制液5.pH5.pH调整液调整液24平衡盐水平衡盐水BSS v用途用途:作为培养基的基础液作为培养基的基础液 洗涤组织、细胞等洗涤组织、细胞等 v成分：成分：无机盐无机盐 葡萄糖葡萄糖 v作用：作用：维持渗透压，调节维

13、持渗透压，调节pHpH，供给能量和无机离子供给能量和无机离子25v常用常用:Hanks:Hanks液液 EarleEarle液液 PBSPBSv 配制要求配制要求:防止钙沉淀防止钙沉淀 良好的缓冲作用良好的缓冲作用2627细胞消化液细胞消化液:1)1)胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)溶液溶液 浓度浓度0.125%0.125%和和0.25%0.25%最适条件最适条件pH8.0pH8.037 37 配制配制无无CaCa2+2+、MgMg2+2+及血清的平衡盐溶液及血清的平衡盐溶液 2)2)乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(EDTA)溶液溶液VersenVersen液

14、，常用浓度液，常用浓度0.020.023)3)其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶28消化酶抑制液消化酶抑制液大豆胰酶抑制液大豆胰酶抑制液终浓度：终浓度：0.1%0.5%常以常以DMEM/F12培养液配制培养液配制过滤除菌过滤除菌-20 保存保存29pH调整液调整液1)1)3.73.7，5.65.6，7.47.4NaHCONaHCO3 3溶液溶液 0.22m0.22m滤膜过滤除菌滤膜过滤除菌 NaHCONaHCO3 3+H+H2 2O NaO Na+OH+OH-+H+H2 2O+COO+CO2 22)2)HEPESHEPES 0.22m0.22m滤膜过滤

15、除菌滤膜过滤除菌30抗生素溶液：抗生素溶液：青、链霉素青、链霉素(双抗双抗)青霉素青霉素抑制细菌细胞壁的合成抑制细菌细胞壁的合成100U/ml100U/ml链霉素链霉素抑制细菌蛋白质的合成抑制细菌蛋白质的合成 100g/ml100g/ml 卡那霉素卡那霉素 制霉菌素制霉菌素31谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液 溶液中不稳定溶液中不稳定 过滤除菌过滤除菌-20-20 保存保存32培养基培养基天然培养基、合成培养基天然培养基、合成培养基营养成分：营养成分：氨基酸：氨基酸：L型型 单糖：葡萄糖单糖：葡萄糖 维生素维生素 其他成分其他成分：核酸降解物、抗氧化剂等：核酸降解物、抗氧化剂等促生长因子及激素促生

16、长因子及激素 pH渗透压渗透压33天然培养基天然培养基 血清血清 组织提取液组织提取液 鸡胚汁鸡胚汁 鼠尾胶原鼠尾胶原 水解乳蛋白水解乳蛋白34血清血清 种类种类:小牛血清小牛血清 牛血清：牛血清：新生牛血清新生牛血清 胎牛血清胎牛血清 马血清马血清 鸡血清鸡血清 兔血清兔血清 羊血清羊血清35主要成分：主要成分：各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。素、无机物等。36血清的主要作用：血清的主要作用：v 提供基本营养物质提供基本营养物质v 提供贴壁和扩展因子提供贴壁和扩展因子v 提供激素和各种生长因子提供激素和各种生长

17、因子v 提供结合蛋白提供结合蛋白v 对培养中的细胞提供某些保护作用对培养中的细胞提供某些保护作用37使用血清的缺点：使用血清的缺点：v可能改变某种细胞在体内的正常状态。可能改变某种细胞在体内的正常状态。v 取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞 产生潜在影响，可能导致实验失败或实验产生潜在影响，可能导致实验失败或实验 结果的不结果的不 可靠性可靠性v 每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致v 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用38血清的质量标准血清的质量标准v

18、理化性质（渗透压、理化性质（渗透压、pHpH、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等）水平、内毒素等）v 微生物检测（细菌、真菌、支原体、病毒等）微生物检测（细菌、真菌、支原体、病毒等）v 促生长效果促生长效果39血清的使用与储存血清的使用与储存v 使用前处理：使用前处理：灭活处理灭活处理5656，30min30min 目的目的去除血清中的补体成分，避免补体去除血清中的补体成分，避免补体 对细胞产生细胞毒作用对细胞产生细胞毒作用v 储存条件：储存于储存条件：储存于-20-20，避免反复冻融，避免反复冻融v 使用浓度：一般为使用浓度：一般为5%5%20%20%，

19、常为，常为10%10%40合成培养基合成培养基 无机盐无机盐v 基本组分：基本组分：氨基酸：氨基酸：1212种必需氨基酸种必需氨基酸 维生素维生素 碳水化合物：葡萄糖碳水化合物：葡萄糖 （酚红）（酚红）v19511951年年,EarleEarle,EarleEarle基础合成培养基基础合成培养基MEMMEM (minimum essential media)(minimum essential media)41合成培养基常见种类合成培养基常见种类:v MEMMEMv DMEM(Dulbeccos modified Earle medium)DMEM(Dulbeccos modified Ear

20、le medium)v RPMI 1640RPMI 1640v 199,109199,109培养基培养基v HamF10,HamF12HamF10,HamF12适合于单个细胞分离培养适合于单个细胞分离培养v McCoys 5AMcCoys 5A适合于原代细胞培养，适合于较难培适合于原代细胞培养，适合于较难培 养的细胞的培养养的细胞的培养42无血清培养基无血清培养基 无血清培养基即不需要添加血清就能维持细胞在体外较无血清培养基即不需要添加血清就能维持细胞在体外较 长时间生长繁殖的合成培养基。长时间生长繁殖的合成培养基。43基础培养液基础培养液HamF12 1 HamF12 1 DMEM 1DMEM 1添加组分添加组分促贴壁物质促贴壁物质促生长因子及激素促生长因子及激素酶抑制剂酶抑制剂结合蛋白和转运蛋白结合蛋白和转运蛋白微量元素微量元素4445种类：种类：