酵母感受态细胞的制备与转化

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1、酵母感妥态细胞的制珞及酵母转化醉母感受态细胞的制备转化烦樓YPDA嚅养至半极 L沽化酵世菌大接直径2-3nd閑怕.応隆1片或爭j- J Ind YPDA或 焙养基1 早好这川凹周之内的瞬咁菌落渦旋打烈甫体糧移到表11 |右面所不休积的YPDA或SD焙养费|刘血150ml150ml3MI iSOrpm,振疡培养 M-lHh, .6门Dft加大于1.5轻移过仪谱养臼L咅养物 J奁小右面所不休枳的MOOmlHOOrrJKKKhnlYTDA屮，如入的呈耍足够便1开上罟誹物屮OD6CK)約达().2-(13SOC , 23(i-27(km. 撮荡帘养 弘 卡.ODd(X)喲 (吵(04 0.龄50ml离

2、心诗.室温lOOOXg,离心5miTL妆集肃休齐1清，/1J灭凿的1 XTE或衣菌煎怖水虫展菌休25-50iil125-50ml500ml令潟.ltlfinx q.离心 5min/P 1清，用灭苗的1 XTEJAc盘新悬浮歯休l.5tmll.5mlfitnl曲备PEG/UAa涪瘢10ml10ml100ml注：酵母转化分列顺序軟化和共转祀”.a /r-J0!序辖化屮.诳行第-：祝转化时用SD-Trp培养拄； 卜.面表I所标出的丄皆养基及试列的律积不是周世不变的，可根册.实验1的丈际倩况调整，如 PEG/UAc 液,，转化时fiDml，若沖备IMmi就很浪蛊“酵母转化小文应在指定管屮混合下列成分.

3、5ml50ml，伽1DKA-BD/ 饵 11fllpg加-1加昭trS-I.OmgAD反库10-50ngHerring icca caaiLT DNA(越色牯 DNA)Inag加g2(Jmg加入酵母感旻态细胞，涡施混匀().1mlIrnlAmi加灭菌的pTLiAc溶液斟旋混匀门 6nnl6m60ml30Cj ZOOrpm” 振荡培养 3(kmn加DMSOt船无池匀或疏转井：此步贯不耍涡说70pl7咖14兀热击国血大规模砌丈庐规模的盅耍不断症冰 1放 _S 1 -2rnin5S(14k-rptriSmin(1000 Xg)5mm(lOOOXg)主温离心，弃卜涓m ixtlHis-Leu :就板：

4、海严谨度的涂SD-Atk-Kis-Lcu-Trp/X-gal四缺板*圧逬行小规模楼化时 将转化子汕卸物涂】00mm的平板匕大规模别丈症转化也 涂】5伽帕平胶。半斯的诱桝刑丈库 箱合时寻找摄住方浓是很瑞的.因戊.分别涂转化子的】口低、川、高严谨度的平板幕 恥。倒豐培养笊比隆出现.一般3天左右 选礙丸隆进行岸半乳將肯酶黒芭实验另外在做互作或文库筛选时，需耍做阳性和阴性对照土 PCII为口激活对照； pGADT7-r+.pGBKT7-53 阳性对胆芒 pGADT7-T+pGBKT7-km 阴性对腔.为了检测母一-仁质粒的转化效率,出lOOpl水稀释ljxl转化亍，锦于SD-Leu和SD-Trp 平板

5、匕 为了检测共转化數芯 按不同比働 1000, 1:1伽1:10)稀韩转化子，取 10011 徐于 SB-Leu-rip T板飞醉用培养基：YPD iwdiuH (1L)Dific peptide (可：|； OKOID 司的.胰化蛋白原20迅20匹950mlIfeaAtexlracl10g/L加俺傭水 调fHS烏压火菌，55(! 右一打40%的葡補糖和ml至终蔽度:2诂.40%荷苗轄：40g葡商糖加別ml左右的戏憐水溶解*然后毎容至ICXhnJ,过滤灭菌：4C 存放。注意.一定金能舟乐火菌，因长时间高温会便葡萄糖变賤YPD medium (1L)1吨20少L950mlD币cpeptone可.

6、用OXOID公刃的咦化蛋白腺)20/LYeajit exinicLA野it ( Ibr pklcK only) 加蒸馆水iJ3pH6 5高圧灭亂 侍净却到飞5上右* iin 4D%的葡葫糖勿ml卒终浓度2%辆匍萄糖上4购简萄糖加血皿左右的蒸憾水辭濮 然启世容至lOOmb过滤火新41 存放。注意，一迟不愷高圧灭菌，因长时间高谥会便葡葡糖变黑YPD A medium (1L)在上血的YPD培养基巾毎升0.2%的腺嗥吟:壯硫酸盐(adHTirc hcirisiiLfate) 15ml至 终敞度0.003%,高JT灭菌一0.2%玄亚nine lipmul佃假 0.2a加100m】捷谓水溶輕即可a注七如

7、果需要在YHXYPDA)中加抗生素如kamTBin,在上面准备的培养基中抑Slkiig/ml 的 Knik2-0 Jud 至终浓度 10-15mg/LSD mediiuik (11).无氮基酸酵母氮源 CycaM. nitro和I hiw: wilful ariiino acid斗 YNB )Ck7冒LDific琼脂wxno(D ific AiTj R)r p kites on ly)Dnipoul SolulitJi瀑楣水20曾L100ml850ml酵母转化所用试剂：娃鱼梢DNA (Herring testes carrierDNA) (10 n/ml)使用前，沸水浴20min立即冰上冷却。

8、为了提髙转化效率，建议使用高质量的鮭鱼精DNA。 PEG/LiAc solution (polyethylene glycol/lithiuin acetate)现用现配终浓度准各l()ml溶液PEG 4000/335040%8 ml 5(駁 PEGTE bulTcrIX1 ml of 10XTELi AcIX1 ml of lOXLiAc储存液(Stock solutions)50% PEG 3350 (Polyethylene glycol,聚乙二醉，分子量为3,350)灭菌去离子水配制，50g 加60ml水加热溶解，然后定容100ml 100% DMSO (Dimethyl sulfox

9、ide),二甲基亚枫 10X TE buffer 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5高压灭菌。 10X UAc: 1 M lithium acetate用稀释的醋酸调pH 7.5髙压灭菌aP-galactosidasc Filter Assays试剂和材料的准备：Whatman 5#滤纸或Grade 410滤纸，灭菌处理银子，用来夹取滤纵Z buffer储存液X-gal储存液Zbuffer/X-gal 溶液液氮操作方法：1. 为了得到最好的结果，用新鲜的克隆（一般3OC培养2-4天）,菌落直径13叭2. 0C buffcr/X-gal 溶液3. 预先将滤纸放在

10、盛有2.5-5.0inl的Zbuflh/X-gd溶液的培养皿中。4. 用银子夹取一张I净、燥的滤纸放在长有苗落的平板上，轻轻用锻子摩擦将滤，帮 助菌落附着在滤奴上。5. 透过滤纸，在=个不同的方位卜号孔（不对称的方位），此方法用于在挤养基上确富 滤纸的方向，6. 当施纸均匀湿润后，用擞于小心将滤纸从培养基上取下，转移到液氮屮，浸没在液氮中1（）妙.7取出液氮中冷冻过的滤纸，室温卜融化。8. 小心将滤纸正而朝上，放任第三步预处理的滤墩上，避免在两层滤城中间产生气泡9. 将带有两层滤纸的培养皿放于30*C或室温下，怎期检查蓝色菌落的出现情况。一股8 小时之内变兰的可初步定位阳性克隆。10. 在平板

11、上找到与蓝色茵落相对应的菌落，挑相应的蓝色菌落到新的培养基平板 上。方法改进：先在一个培养皿中铺一张普通灭歯滤纸，再加2.5-5.01111 Z buffer/X-gal液将滤纸润湿：级后将显色滤纸（Whatman 5#滤纸或Guide 410滤纸）剪成长方形，放在培 养皿中，加少量灭菌水润湿，用牙签挑取菌落轻轻在滤纸I：划线，宜接液氮冷冻10妙钟， 取岀室温融化，放在预先准备好的滤纸匕避免在两层滤纸间产生气泡，做好标记后， 放在30C或室温下，宦期检查蓝色菌落的出现情况。一般8小时之内变兰的可初步企位阳 性克隆幺储存液Z buffer储存液Na2HPO4 7H2ONaH2PO4 H2OKC1

12、MgSO4 7H2O16.1 叽5.50 业0.75 40.246 0L调pH 7.0高压灭菌，室温可以保存一年。 X-gal储存液溶解 20mg5+貝 4 氯 3 蚓| 喙-卜 D半乳 (5-bromo-4-chbn)-3-indolyl-P-D- ga lac top jTanos ide. X-GAL)于 100ml N,N 二甲基甲酰 (N dimet hy lformcimide, DMF)中，配成浓度为20 mg/ml, _20C黑暗储存。Zbuffei/X-gal 溶液100 ml0.27 ml1.67 mlZhufferP-niercaptoctliaiiol (P-ME)X-gal储存液