51环境毒理学常用实验方法

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1、u 实验动物（laboratory animal）经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。u 温血动物(恒温动物)兔、豚鼠、大鼠、小鼠 有时也用猴、狗、猫等实验动物的选择实验动物的选择狗 小鼠小鼠 大鼠 豚鼠豚鼠 实验动物的选择实验动物的选择种属的选择 个体选择 年龄 体重 性别 生理状态 健康状况 实验动物的选择实验动物的选择种属的选择u 机体反应上尽量近似于人体；u 易获得、易饲养、易管理；u 最敏感、最合适；u 选用几种不同种属的动物(对毒作用不清楚的化学物质)；u 借助已有毒理学研究资料选择。实验动物的选择实验动物的选择借助已有毒理学研究资料选

2、择 气体、蒸气对粘膜的刺激作用猫 毒物对皮肤的局部作用豚鼠或兔(皮肤对刺激物的反应近似于人)过敏性反应豚鼠(易于致敏)观察致呕吐作用的实验研究狗、猫 外界环境因素引起机体体温过高及体温过低的反应兔或猫(大鼠、小鼠对于体温调节不稳定)高血压病理狗、兔、大鼠(易出现血压变化)物质的致癌作用小鼠和大鼠 慢性中毒损害实质性脏器的毒物小鼠(实质性脏器容易罹患病变)年龄 除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者。性别 根据目的，若对动物性别无特殊要求，宜选用雌雄各半。生理状态怀孕、哺乳 通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，为了某种特定的实验目的除外。健康状况 所用动物进入实验室后，于实验开始前应观

3、察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。实验动物的选择实验动物的选择(1）经口 灌胃、喂饲、吞咽胶囊（2）经呼吸道 动物自行吸收（静式吸入染毒、动式吸入染毒）人工动物气管注入（3）经皮肤（4）其它途径 注射途径 (1)(1)经口染毒经口染毒 灌胃灌胃 用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内；用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内；直接灌入胃内，不与口腔及食道接触；直接灌入胃内，不与口腔及食道接触；给予的化学物剂量准确。给予的化学物剂量准确。喂饲喂饲 将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依

4、每日食入的饲料与物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水再推算动物实际摄入化学物的剂量。水再推算动物实际摄入化学物的剂量。(1)(1)经口染毒经口染毒 优点：优点：接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式，接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式，方法简便、易操作。方法简便、易操作。缺点缺点 进食时浪费、损失饲料多，摄入的量进食时浪费、损失饲料多，摄入的量不准确不准确；如果化学物有异味，动物可能拒食；如果化学物有异味，动物可能拒食；如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以水解，如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以水解，则剂量也不准确；则剂量也不准确

5、；有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能；有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能；更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。(1)(1)经口染毒经口染毒 吞咽胶囊吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法。兔、猫及狗等较大动物可用此法。液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式

6、经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，角质层薄的皮肤部位更易吸收。实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象，剔除不合格动物。染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量。接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。（3）经皮肤染毒）经皮肤染毒动物实验的一般操作方法一、急性毒性的概念一、急性毒性的概念 急性毒性急性毒性是指机体是指机体(人或实验动物人或实验动物)一次一次或或24h24h之内之内多多次次接触接触(染毒染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应。应，包括

7、引起死亡效应。一次一次：瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但：瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程，续地接触化学物的过程，“一次一次”含有时间因素。含有时间因素。多次多次：当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机：当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h24h内内分次染毒。分次染毒。二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的 探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能探

8、求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能毒害的危险性；毒害的危险性；求该化学物的剂量求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下反应关系，为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础。选择染毒剂量的基础。表示急性毒性大小：表示急性毒性大小：LD50三、急性毒性试验的内容三、急性毒性试验的内容（1）急性毒性测定）急性毒性测定 确定一次染毒的确定一次染毒的 LD50或或LC50；（2）经皮肤染毒实验）经皮肤染毒实验 考察受检化学物质能否经皮肤进入体内，考察受检化学物质能否经皮肤进入体内，LD50；（3）局部作用实验）局部作用实验 通过使受检化学物质直接接触皮肤及眼结膜等试验，研究通过使受检化学物质直

9、接接触皮肤及眼结膜等试验，研究其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。三、急性毒性试验的内容三、急性毒性试验的内容（4）中毒症状的观察）中毒症状的观察 据染毒动物症状及体征，粗略了解毒物作用的程度和可能据染毒动物症状及体征，粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。作用部位。（5）功能及病理组织学检查）功能及病理组织学检查 选择必要的功能指标，寻求毒作用剂量与功能改变的关系，选择必要的功能指标，寻求毒作用剂量与功能改变的关系，确定急性阈剂量；确定急性阈剂量；通过病理组织学检查，进一步了解毒作用部位及毒害程度。通过病理组织学检查，进一步了解毒作用部位及

10、毒害程度。一般采用小动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等。一般采用小动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等。实验动物应预先观察实验动物应预先观察7天左右，以了解其健康情况及正常活天左右，以了解其健康情况及正常活动状态。动状态。正式实验时，按随机分组原则分组，一般分成正式实验时，按随机分组原则分组，一般分成56个实验个实验组组(必要时备对照组必要时备对照组)，每组，每组510只动物只动物(小鼠多用小鼠多用10只只)。四、哺乳动物的急性毒性实验四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定（二）急性阈剂量的测定 2.实验方法实验方法（1）游泳试验）游泳试验主要是通过观察动物的活动能力，揭示不同剂量的毒物对机主要是通过

11、观察动物的活动能力，揭示不同剂量的毒物对机体体力影响的程度，是研究阈剂量体体力影响的程度，是研究阈剂量(或浓度或浓度)的常用指标。的常用指标。实验动物一般用小鼠或大鼠。实验动物一般用小鼠或大鼠。记录每只动物自放入水中至口鼻沉没到水下记录每只动物自放入水中至口鼻沉没到水下5秒钟的时间，秒钟的时间，即游泳时间。在游泳过程中记录游泳速度、运动姿势等。即游泳时间。在游泳过程中记录游泳速度、运动姿势等。比较染毒组与对照组游泳时间和速度以及游泳姿势上的差异比较染毒组与对照组游泳时间和速度以及游泳姿势上的差异并进行评价。并进行评价。四、哺乳动物的急性毒性实验四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定（

12、二）急性阈剂量的测定 2.实验方法实验方法（2）刺激阈试验）刺激阈试验刺激性气体或蒸汽，对上呼吸道、眼睛和口腔等器官的黏膜刺激性气体或蒸汽，对上呼吸道、眼睛和口腔等器官的黏膜会产生局部刺激作用，通过观察毒物在不同浓度下引起的刺会产生局部刺激作用，通过观察毒物在不同浓度下引起的刺激症状，可找出毒物引起刺激症状的最低浓度，即阈浓度。激症状，可找出毒物引起刺激症状的最低浓度，即阈浓度。实验动物多用猫。实验动物多用猫。观察指标除一般刺激症状，如流泪、流涕、等以外，主要观观察指标除一般刺激症状，如流泪、流涕、等以外，主要观察动物的流涎出现的时间及严重程度。察动物的流涎出现的时间及严重程度。将将50以上动

13、物出现以上动物出现“有少量唾液流到口唇周围有少量唾液流到口唇周围”以上程度以上程度的刺激症状的最小浓度作为阈浓度。的刺激症状的最小浓度作为阈浓度。四、哺乳动物的急性毒性实验四、哺乳动物的急性毒性实验（三）局部作用试验（三）局部作用试验 用于研究一些化学物质引起接触的皮肤和黏膜的症状，用于研究一些化学物质引起接触的皮肤和黏膜的症状，如炎症和烧伤。如炎症和烧伤。1.急性皮肤刺激急性皮肤刺激/腐蚀试验腐蚀试验为了确定化学物质对哺乳动物的皮肤是否具有刺激或腐蚀作为了确定化学物质对哺乳动物的皮肤是否具有刺激或腐蚀作用。用。选用白色豚鼠或家兔作为实验动物。选用白色豚鼠或家兔作为实验动物。观察涂抹部位的皮肤

14、反应，对刺激作用给予全面完整的评价。观察涂抹部位的皮肤反应，对刺激作用给予全面完整的评价。四、哺乳动物的急性毒性实验四、哺乳动物的急性毒性实验（三）局部作用试验（三）局部作用试验 2.急性眼睛刺激急性眼睛刺激/腐蚀试验腐蚀试验结膜囊染毒试验。结膜囊染毒试验。试验常选用家兔或豚鼠为实验动物。试验常选用家兔或豚鼠为实验动物。将受试化学物将受试化学物0.1mL滴人一侧眼结膜囊内，用手将眼睑压住，使滴人一侧眼结膜囊内，用手将眼睑压住，使闭眼几秒钟，另一侧眼滴生理盐水作对照。闭眼几秒钟，另一侧眼滴生理盐水作对照。记录滴药后记录滴药后1h、12h、24h、48h、72h和和96h的局部反应，如充的局部反应

15、，如充血、水肿、流泪、怕光、角膜、结膜和眼球损害的程度以及恢复血、水肿、流泪、怕光、角膜、结膜和眼球损害的程度以及恢复的时间等。的时间等。以规定的间隔时间观察刺激或腐蚀作用的程度，同时作进一步描以规定的间隔时间观察刺激或腐蚀作用的程度，同时作进一步描述以便对刺激作用给予全面、完整的评价。述以便对刺激作用给予全面、完整的评价。五、水生动物毒性实验五、水生动物毒性实验 一些水生生物对水质变化很敏感，反应显著。因此，在环一些水生生物对水质变化很敏感，反应显著。因此，在环境毒理实验中常用水生生物作为实验动物，特别在制订污水境毒理实验中常用水生生物作为实验动物，特别在制订污水排放标准时，常进行水生生物的

16、急性毒性实验。排放标准时，常进行水生生物的急性毒性实验。鱼类鱼类、甲壳动物、藻类毒性实验等方法。、甲壳动物、藻类毒性实验等方法。鱼类毒性实验鱼类毒性实验1.实验用鱼的选择实验用鱼的选择必须具有一定区域代表性，便于在实验条件下饲养，对化学必须具有一定区域代表性，便于在实验条件下饲养，对化学物质较为敏感。物质较为敏感。短期试验多采用我国的青、草、鲢、鳙四大养殖淡水鱼，一短期试验多采用我国的青、草、鲢、鳙四大养殖淡水鱼，一般体长般体长机体消除速度不断累积毒性作用阈剂量蓄积毒性作用蓄积毒性作用 环境污染物在体内的蓄积作用的过程，表现为：物质蓄积物质蓄积：污染物不断进入机体，其吸收量排出量，以致在体内的

17、贮留量增多；功能蓄积功能蓄积：不断进入机体内的环境污染物，反复作用机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。相对的区分，同时存在，互为基础蓄积毒性作用蓄积毒性作用环境污染物在体内的蓄积作用，是引起亚慢性和慢性毒性作用的基础。常是评估环境污染物毒性作用的指标之一；制定其在环境中的卫生标准的重要参考依据。阐明污染物有无蓄积作用及其程度有重要意义。一、试验方法一、试验方法（一）蓄积系数法（一）蓄积系数法 固定剂量每天连续染毒法固定剂量每天连续染毒法（二）（二）2020天蓄积试验法天蓄积试验法（三）生物半减期法（三）生物半减期法一、试验方法一、试验方法（一）蓄积系数法（

18、一）蓄积系数法（cumulative coefficient method）分次分次给受试物后引起给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂受试动物出现某种毒效应的总剂量（量（LD50(n)表示）与表示）与一次一次给受试物后引起给受试物后引起50%受试动物出现受试动物出现同一毒效应的剂量（以同一毒效应的剂量（以LD50(1)表示）的比值，即表示）的比值，即)1(50)(50LDLDKn蓄积作用强度分级蓄积作用强度分级一、试验方法一、试验方法（一）蓄积系数法（一）蓄积系数法一、试验方法（一）蓄积系数法1.固定剂量每天连续染毒法固定剂量1/10-1/20LD50每天染毒一次观察死亡情况5个L

19、D50时，若动物死亡数未超过半数，K5，表明蓄积作用不明显。如果染毒过程中动物相继死亡，记下受试动物出现半数死亡时的累计的染毒总剂量，按上述计算蓄积系数。分次染毒剂量为1/20 LD50时，实验时间可长达100天，分次染毒剂量为1/10 LD50时，实验还可长达50天。一、试验方法一、试验方法一、试验方法一、试验方法一、试验方法一、试验方法（三）生物半减期法（三）生物半减期法生物半减期生物半减期（T1/2）指一种外来化合物在体内消除到原有）指一种外来化合物在体内消除到原有浓度浓度(或量或量)的一半所需要的时间。的一半所需要的时间。生物半减期越长的物质，表示越不易由体内消除，其蓄积生物半减期越长的物质，表示越不易由体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。作用的可能性就越大。测定生物半减期较为复杂，实际观测中常常仅以间接测定测定生物半减期较为复杂，实际观测中常常仅以间接测定其在血液、尿液或器官组织中的浓度（或量）降低一半所其在血液、尿液或器官组织中的浓度（或量）降低一半所需的时间，以代表该物质的生物半减期。需的时间，以代表该物质的生物半减期。一、试验方法一、试验方法