乳酸菌之检验

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1、食品微生物之檢驗方法乳酸菌之檢驗101年6月7日署授食字第1011902050號公告1. 適用範圍：本方法適用於食品中乳酸菌之檢驗。2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以選擇性培養基培養及計數之方法。2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線好，操作平台光為 100呎燭光以上，密閉室內換氣好， 儘可能沒有灰塵及動空氣。每15分鐘菌得超過15 C FU/培養皿。2.2. 器具及材料2.2.1. 乾熱滅菌器。2.2.2. 高壓滅菌釜。2.2.3. 冰箱：能維持5 土 3。（者。2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差土 1.0C以內者。2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差 土 1.0。以內者。2.

2、2.6. 攪拌均質器（Blender或鐵胃（Stomachej :能適用於無菌操作者。2.2.7. 天平：可稱到 2000 g,敏為 0.1 g;可稱到 120 g,敏為 5 mg。2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mix0r。2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH mete。2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。2.2.11. 厭氧缸（Anaerobic j）或厭氧培養箱：適用於厭氧培養者。2.2.12. 吸管輔助器（Pipette aid2.2.13. 吸管（Pipet）:已滅菌。1 m L吸管應有0.01 m I之刻；5 m L及10 m L吸管應有0.1 m L 刻。2.2.

3、14. 培養皿：已滅菌,內徑約 90 mm ,深約 15 mm ,底皿之內外面應平坦,無氣泡、刮痕或其他缺點。2.2.15. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、99 m L及90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣瓶。2.2.16. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。2.2.17. p試紙：範圍6-82.2.18. 無菌膜：孔徑 0.2 “m或以下之親水性醋酸纖維濾膜。2.2.19試 藥：葡萄糖(dex tros)、聚山梨醇酯 80 (polysorba te 80, Twee/、磷酸氫二鉀(HPO 4)、醋 酸鈉(sodium acet)e 檸檬酸銨(ammo

4、nium citrate、硫酸鎂(MgSO 4 7H2O )、硫酸錳(MnSO 4 4H2O)、碳酸鈣、磷酸二氫鉀(KH2PO丿、硫酸銨(NH4)2S04)、L-半胱胺酸鹽(L-cysteineHCl H2O )、丙酸鈉(sodium propionate 轉半乳糖苷寡醣(transgalactosylated oligosaccharides疊TOS 氮化鈉(sodium azide、2,3,5三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chlo)i及莫 匹T羅 星鋰(lithium mupirogi均採用化學試藥級；蛋白腖(pepton?、牛肉抽出物(beef

5、 ext讨其酵母 抽出物(yeast extr)ct胰蛋白腖(trypto9e及洋菜均採用微生物級。2.2.20. 0.蛋白腖稀釋液(0.1% pep tone dil)之配製：取蛋白腖1 g溶於蒸餾水，使成1000 mL,分裝 於稀釋用容器中，經12FC滅菌15分鐘，最終pH值為7.0 土 0.1。2.2.21. 培養基(註)2.2.21.1. MRS 培養基(MRS agar, MRSA)蛋白腖（pep tone10g牛肉抽出物（beef extrNct10g酵母抽出物（yeast extract5g葡萄糖（dex tro）20g聚山梨醇酯80 （polysorbate 80, Twee）

6、n801g磷酸氫二鉀（K2HP0 4）2g醋酸鈉（sodium ace ta）e5g檸檬酸銨（ammonium cit rate2g硫酸鎂（MgSO 4 7H2O）0.1 g硫酸錳（MnSO 4 4H2O）0.05 g洋菜（agai）15 g蒸餾水1000 m L加熱溶解後，以12FC滅菌15分鐘，最終pH值為6.5 土 0.2若需添加碳酸鈣，則稱取碳酸鈣5 g,預先以180C乾熱滅菌1一2小時，加入上述培養 基中，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為6.5 土 0.2。2.2.21.2. 轉半乳糖苷寡醣-莫匹羅星培養基(Transgalactosylated oligosaccharides

7、-mupirocin medium, TOS-MUP )基礎培養基(Basic medium :轉半乳糖苷寡醣-丙酸鹽培養基(TOS-propionate agar medium蛋白腖（pep tone10 g酵母抽出物（yeast extract1 g磷酸二氫鉀（KH 2PO4）3 g磷酸氫二鉀（K2HPO 4）4.8 g硫酸銨（NH4）2SO4）3 g硫酸鎂（MgSO 4 7H2O）0.2 gL-半胱氨酸鹽（L-cysteineHCl H2O ）0.5 g丙酸鈉（sodium propionate15 g轉半乳糖苷寡醣（t ransgalac tosyla ted oligosacchar

8、ides, TOS10 g洋菜（agai）15 g蒸餾水950 mL攪拌加熱溶解後，每瓶分裝190 mL,以115C滅菌15分鐘，最終pH值為6.3 土 0.2。配 製好之基礎培養基置於2- 4C冷藏條件下，可儲存1週。莫匹羅星補充溶液(MUP supplement solut)n稱取莫匹羅星鋰(lithium mupiroin0 mg溶於蒸餾水50 mL,以無菌膜過濾，臨用時配完全培養基(Complete medium取配製好之基礎培養基，加熱溶解冷卻至48 土 1C,每90 m L加入莫匹羅星補充溶液10 mL （最終濃度為50 mg/L），小心混勻避免氣泡產生，冷卻至約48C使用。2.2

9、.21.3. 腸球菌培養基（Enterococcus agar胰蛋白腖（t ryp toSe20g酵母抽出物（yeast extract5g葡萄糖（dex tro）2g磷酸氫二鉀（K2HP0 4）4g疊氮化鈉（sodium azide0.4g2,3,5三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyl tet razolium chloride, TTC0.1g洋菜（agai）10g蒸餾水1000 mL加熱沸騰1分鐘，使培養基完全溶解，最終pH值為7.2 土 0.2。註：1本方法之MRS培養基適用於總乳酸菌之計數；轉半乳糖苷寡醣漠匹羅星培養基適用於雙叉桿菌之計 數；腸球菌培養基適用於腸球菌之計數

10、。2. 特殊營養需求之菌株，可依其菌株特性探討適合之培養基。3. 計數複合菌株時，若採用多種培養基，應排除重複計數之可能。2.3. 檢液之調製：2.3.1. 固態檢體：將檢體碎混合均勻後，取50 g,加入0.1%蛋白腖稀釋液450 mL，混合均勻，作為10倍稀釋檢液。2.3.2. 粉、或其他於粉碎之檢體：以已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後,混合均勻,取 50 g,以下步驟同 2.3.1節.之操作。2.3.3. 液態檢體：將檢體振搖均勻混合，取50 m L,作為原液，以下步驟同2.3.1節之操作。2.3.4凍檢體：須解凍者，如凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等，應在藏之溫下解凍（如2 5C ,18小時

11、內即可解凍完全）；亦可使用較高溫快速解凍（置於 45C以下之水浴中，可在15分鐘內 解凍之檢體適用之）。解凍時應經常搖動檢體，以加速解凍。解凍後，再予以碎並混合均勻。須解凍者，如食用冰塊、冰棒等冰製品，應速先使成適當小塊；再依照 2.3.1節.方法，製成10 倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進，應將檢體貯存於-20C。2.3.5. 凝態及濃稠液態檢體：如布丁、乳、海苔醬等檢體，經攪拌均勻後，取50 g,以下步驟同2.3.1 . 節之操作。2.3.6. 系稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液10 mL,加至0.1%蛋白腖稀釋液90 mL中，依序作成100倍、1000倍、10000倍

12、等一系稀釋檢液，其稀釋方法如下圖所示。50g50mL （原液）10倍IQmL10 mL10 mL10 mL90 mL90 mL90 mLlOOffi1000K10000倍2. 4.乳酸菌之培養：2.4.1. 將2.3節.之稀釋檢液及（或）原液充分振搖,混合均勻。2.4.2. 吸取各稀釋檢液及（或）原液1 mL,分別置入培養皿中，各檢液至少作二重複。2.4.3. 2.4.2節之各培養皿，分別倒入43 45C之培養基15_20 mL,搖動混合。2.4.4將2.4.3節之培養基平板靜置，待培養基凝固後，置於35 37C厭氧培養72 土小時，腸球菌之培 養則採好氧培養2448小時。2.5.乳酸菌之計算

13、：2.5.1觀察菌落之生長狀態，添加碳酸鈣於MRS培養基中，使其濃度為0.5%，為選擇性培養基，乳酸菌菌 落會產生透明環；TOS-MUP培養基中，典型雙叉桿菌為白色菌落，直徑約1 4 mm ;腸球菌培養 基中,腸球菌為紅色菌落。2.5.2. 菌數之計數：選取25250個菌落之平板進行計數，其菌之表示方式為 CFU/g或CFU/mL，記 菌時應將該數字第三位數字四捨六入（當第三位數字為五時,遇第二位數字為奇數時進位,偶數 時捨去）,使其有效數為兩位。2.6. 檢驗流程圖 、 50g(mL)-加入稀釋液450mL，作成】0倍蹄極製端100倍、1000倍等系列術釋檢液1- 1r稀釋檢液充分振擒，混合均勻，分別吸取ImL注入i咅養皿中，各檢液至少作二巫極各培養皿中倒入羽45上之滅菌培養基15-20 mL *搖動混合*待培垂墓凝固後，倒置於站3兀厭氫培養72 3 hr腸球菌之培養則I採好氧培養24-48 hr選取25-250個菌落之平板，其菌數之表示方式爲 CFL/g 或 CFU/niL