酶分子修饰.PPT

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1、第十二章第十二章 酶分子修饰酶分子修饰2一、酶分子修饰的原因n酶在生物技术中占有核心地位酶在生物技术中占有核心地位n酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温和等优点，在工业、农业、医药等方面得温和等优点，在工业、农业、医药等方面得到越来越多的应用。到越来越多的应用。3n大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种现象的原因是多方面的，这主要表现在：现象的原因是多方面的，这主要表现在：(1)(1)稳定性稳定性n酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离开其本身特定的作用环境，在发酵分离

2、提纯、开其本身特定的作用环境，在发酵分离提纯、反应、制剂及固定化等过程中，常常显得不够反应、制剂及固定化等过程中，常常显得不够稳定，不能适应大量生产条件的需要。稳定，不能适应大量生产条件的需要。4（2）作用的最适条件）作用的最适条件（pH中性、室温，溶液中性、室温，溶液状态）状态）一般酶反应是在基本接近中性，与室温相距不一般酶反应是在基本接近中性，与室温相距不大的水溶液中进行的。大的水溶液中进行的。n在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作用时的作用时的pHpH常常不在中性范围内。常常不在中性范围内。n温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往不稳温度升高，

3、酶促反应速度加快，但酶往往不稳定，如果降低温度，又影响反应速度。定，如果降低温度，又影响反应速度。n底物不溶于水时，酶就更难发挥作用。底物不溶于水时，酶就更难发挥作用。5（3 3）酶的主要动力学性质的不适应）酶的主要动力学性质的不适应 （Km值大，与底物的亲和力小）值大，与底物的亲和力小）n米氏常数米氏常数Km值过大，使反应在值过大，使反应在低底物浓度低底物浓度下下不能高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度不能高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低，对较低，对Km较大的酶用于临床检测或治疗时，较大的酶用于临床检测或治疗时，影响就更大。影响就更大。6（4 4）临床应用的特殊要求）临床应用的特殊要

4、求n绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说这些酶都是外源蛋白质，具有抗原性，都有可能这些酶都是外源蛋白质，具有抗原性，都有可能引起人体的过敏反应。引起人体的过敏反应。n酶进入人体后也常会由于一些蛋白酶、抑制剂或酶进入人体后也常会由于一些蛋白酶、抑制剂或抗体的作用而失去其活力，特别是当酶进入体内抗体的作用而失去其活力，特别是当酶进入体内以后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤以后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤为明显。为明显。7（一）（一）如何增强酶天然构象的稳定性与耐热如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性性?（二）（二）如何保护酶活性部位与抗

5、抑制剂如何保护酶活性部位与抗抑制剂?（三）（三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶水解酶?（四）（四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境?总结总结:解决的问题解决的问题？8 二二、酶的分子工程（一）基本内容（一）基本内容 1、酶分子改造：、酶分子改造：对酶蛋白的主链对酶蛋白的主链“切割切割”，即根据酶的结构与功能的，即根据酶的结构与功能的研究，通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性研究，通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性无关而有碍应用的部分，提高其活性，增加稳定性。无关而有碍应用的部分，提高其活性，增加稳定性。2

6、、酶分子模拟：、酶分子模拟：根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、制，用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、较稳定的新型催化剂。较稳定的新型催化剂。（模拟酶）（模拟酶）9 3、酶的化学修饰：酶的化学修饰：即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。10（二）酶的分子工程分类（二）酶的分子工程分类

7、 1 1、分子生物学水平、分子生物学水平n利用工程方法对利用工程方法对DNADNA或或RNARNA进行分子改造，以期进行分子改造，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶蛋白。理的酶蛋白。11 2 2、蛋白质水平、蛋白质水平 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构。人们用化学法或酶法对酶的一级结酶的结构。人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造。构进行改造。n包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象更为将肽链切断或部分切

8、除，使酶的空间构象更为稳定。稳定。n另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。酶的化学修饰。125.1 5.1 什么是酶分子修饰？什么是酶分子修饰？n通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。13酶分子修饰的意义酶分子修饰的意义n提高酶的催化效率催化效率n增强酶的稳定性稳定性 stabilitystabilityn降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological propertyimmunolog

9、ical propertyn研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure structure 145.2 酶分子修饰的基本要求和条件酶分子修饰的基本要求和条件 n对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。n（1 1）酶的稳定性）酶的稳定性n热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。、抑制剂等。（2 2）酶活性中心的状况）酶活性中心的状况 n活性中心基团、辅因

10、子等。其他如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。155.3 5.3 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 n金属离子置换修饰金属离子置换修饰n大分子结合修饰大分子结合修饰n酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰n肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰n核苷酸链剪切修饰核苷酸链剪切修饰n氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰n核苷酸置换修饰核苷酸置换修饰n酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰16 第一节第一节 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 一、一、概念概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。17二、作用范围二、作用范围n含有金属离子的酶含

11、有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。则可使酶呈现不同特性。超氧化物歧化超氧化物歧化酶（酶（SOD）分子中的分子中的Cu2+、Zn2+19金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 a.酶的分离纯化：b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一

12、定量的金属螯合剂，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。p c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。p金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。子的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。20 作用：1、阐明金属离子对酶作用的影响、阐明金属

13、离子对酶作用的影响2、提高酶活力、提高酶活力 如如:将其它杂离子型的将其它杂离子型的-淀粉酶都换成钙离子型淀粉酶都换成钙离子型,会提高酶活力与稳定性会提高酶活力与稳定性;结晶钙型结晶钙型-淀粉酶活力比一般结晶杂离子型淀粉酶活力比一般结晶杂离子型-淀粉酶活力提高淀粉酶活力提高3 3倍以上，倍以上，稳定性也大增。稳定性也大增。蛋白酶蛋白酶(锌型，锌型，Zn2+):用用Ca2+置换置换Zn2+成钙型蛋白酶，钙型蛋白酶活性提高成钙型蛋白酶，钙型蛋白酶活性提高2030%。3、增强酶的稳定性、增强酶的稳定性 如如:Fe-SODMn-SOD,对对H2O2稳定性增强稳定性增强,对对NaN3敏感性显著降低敏感性

14、显著降低.214、改变酶的动力学特性包括Km与最适pH和最适温度等 四、常用的金属离子四、常用的金属离子n二价离子：二价离子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。等。第第2节节 大分子结合修饰大分子结合修饰 利用水溶性大分子与酶结利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合合修饰法，简称为大分子结合法。目前应用最广泛的酶分子法。目前应用最广泛的酶分子修饰方法。修饰方法。23大分子修饰的过程大分子修饰的

15、过程1、修饰剂的选择、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。PEG应用最为广泛应用最为广泛n溶解度高，既能溶解于水，溶解度高，既能溶解于水，也能溶解大多数有机溶剂也能溶解大多数有机溶剂n通常没有抗原性也没有毒通常没有抗原性也没有毒性性n生物相溶性好生物相溶性好n分子末端具有两个可以被分子末端具有两个可以被活化的羟基，可以通过甲活化的羟基，可以通过甲氧基化将其中一个羟基屏氧基化将其中一个羟基屏蔽起来，成为只有一个可蔽起

16、来，成为只有一个可被活化羟基的单甲氧基聚被活化羟基的单甲氧基聚乙二醇（乙二醇（MPEG）。）。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD-SOD 35 h35 h 350350n常用的大分子修饰剂单甲氧基聚乙二醇（MPEG）可以采用多种不同的试剂进行活化，制成可以在不同条件下对酶分子上不同基因进行修饰的聚乙二醇衍生物。2、修饰剂的活化、修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般

17、需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。262728293、修饰、修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。4）分离：分离：通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度修饰度的酶的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶修饰酶。二、大分子结合修饰的作用二、大分子结合修饰的作用n提高酶催化效率提高酶催化效率:每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶催化效率达到

18、原有酶活力的5.1倍等。n增强酶的稳定性：增强酶的稳定性：利用聚乙二醇修饰SOD可将其相对稳定性提高350倍。n降低或消除酶蛋白的抗原降低或消除酶蛋白的抗原:利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，精氨酸酶经聚乙二醇（PEG）结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性；聚乙二醇结合修饰后的L-天门冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。n采用一定的方法使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能，这种酶分子修饰方法称为酶蛋白侧链基酶蛋白侧链基团修饰团修饰。n由于酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学修化学修饰法

19、饰法。第三节第三节 酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰n在酶学方面可以用于研究酶分子的结构和功能，可以测定某一种基团在酶分子中的数量。n在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶的催化特性和催化功能的改变，以提高酶的使用价值。n还可能获得自然界原来不存在的新酶种，如某些抗体酶和人工改造的核酸类酶等。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，主要包括：主要包括：n氨基n羧基n巯基n胍基n酚基n吲哚基n咪唑基各种小分子修饰剂双功能团的化合物进行分子内交联修饰，如戊二醛、己二胺等各种大分子与酶分

20、子的侧链基团形成共 价键而进行大分子结合修饰修饰方法修饰方法一、氨基的化学修饰一、氨基的化学修饰 常用氨基修饰试剂：亚硝酸、醋酸酐、琥珀酸酐、，常用氨基修饰试剂：亚硝酸、醋酸酐、琥珀酸酐、，-三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）、）、,-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）、碘代）、碘代乙酸、丹磺酰氯（乙酸、丹磺酰氯（DNS）、）、O-甲基异脲。甲基异脲。R-CH-COOH+HNO2=R-CH-COOH+N2+H2O|NH2 OH 如用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链如用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基产生脱胺作用，变成羟基。经过修饰中的赖

21、氨酸残基上的氨基产生脱胺作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期延长后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期延长2倍。倍。，-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNS）（又）（又称二甲氨基萘磺酰氯）称二甲氨基萘磺酰氯）n可以专一地与多肽链N端氨基酸残基的氨基反应。据此可以进行肽链的N端氨基酸的检测。二、羧基的化学修饰二、羧基的化学修饰 常用羧基修饰试剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙常用羧基修饰试剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇醇-盐酸试剂、异唑盐等盐酸试剂、异唑盐等E-C-OH+R-N=C=N-R=E-C-O-C=N-R|O O NH-R

22、 酶 碳二亚胺 酶碳二亚胺衍生物 碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用用此修饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目。此修饰法可以定量测定酶分子中羧基的数目。三、巯基修饰n巯基的亲核性很强，是酶分子中最容易反应的侧链基团之一。n通过巯基修饰，往往可以显著提高酶的稳定性。n常用的巯基试剂有酰化剂、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠。其中烷基化试剂（如碘乙酸等）是一种重要的巯其中烷基化试剂（如碘乙酸等）是一种重要的巯基修饰剂，经过烷基化修饰的酶分子相当稳定，基修饰剂，经过烷基化修饰的酶分子相当稳定，而且通过荧光检测技术很

23、容易检测其修饰结果。而且通过荧光检测技术很容易检测其修饰结果。现在已经开发出许多含有碘乙酸的荧光试剂。现在已经开发出许多含有碘乙酸的荧光试剂。E-SH+ICH2COOH=E-S-CH2COOH+HI 酶 碘乙酸 酶-乙酸衍生物N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEM）是一种反应专一性很强的巯基修饰）是一种反应专一性很强的巯基修饰剂剂,能与酶分子的巯基形成稳定的衍生物能与酶分子的巯基形成稳定的衍生物,反应产物在反应产物在300nm处有处有最大光吸收。最大光吸收。四、胍基修饰四、胍基修饰n精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环已二酮、丙二醛、苯乙二醛等，都

24、可以用作胍基修饰剂。经过胍基修饰后的酶蛋白，其空间构象将有所改变。五、酚基修饰n酚基的修饰包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰。酚基修酚基的修饰包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰。酚基修饰的方法主要有碘化法、消化法、琥珀酰化法等。饰的方法主要有碘化法、消化法、琥珀酰化法等。n其中四硝基甲烷（其中四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰。）可以高度专一地对酚羟基进行修饰。例如，枯草杆菌蛋白酶的第例如，枯草杆菌蛋白酶的第104位酪氨酸残基上位酪氨酸残基上的酚基经四硝基甲烷消化修饰后，生成的酚基经四硝基甲烷消化修饰后，生成3-硝基酪氨酸硝基酪氨酸残基，由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的

25、残基，由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的结合力显著增加。结合力显著增加。六、咪唑基修饰 常用的咪唑基修饰剂有碘乙酸、焦碳酸二乙酯等。七、吲哚基修饰七、吲哚基修饰n色氨酸残基由于其疏水性较强，通常位于酶分子的内部。而色氨酸残基由于其疏水性较强，通常位于酶分子的内部。而且比较不活泼，其反应性比较差。所以一般的试剂难于对吲且比较不活泼，其反应性比较差。所以一般的试剂难于对吲哚基进行修饰。哚基进行修饰。八、八、分子内交联修饰分子内交联修饰n通过分子内交联修饰，可以使酶分子的空间构象更为稳定，通过分子内交联修饰，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶分子的稳定性。从而提高酶分子的稳定性。n例如

26、，采用葡聚糖二乙醛对青霉素酰化酶进行分子内交联例如，采用葡聚糖二乙醛对青霉素酰化酶进行分子内交联修饰，可以使该酶在修饰，可以使该酶在55条件下的半衰期延长条件下的半衰期延长9倍，而其倍，而其最大反应速度不改变。最大反应速度不改变。采用双功能基团化合物与酶分子相距相近两个侧链基团之间形采用双功能基团化合物与酶分子相距相近两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法双功能基团化合物根据其功能基团的特点可以分为：双功能基团化合物根据其功能基团的特点可以分为：n同型双功能基团化合物的两端具有相同的功能基团同型双功能基团化合物的两端具有相同的功能基团

27、OHC-（CH2）3-CHOn异型双功能基团化合物的两端具有不相同的功能基团异型双功能基团化合物的两端具有不相同的功能基团n值得注意的是分子内交联是在同一个酶分子内进值得注意的是分子内交联是在同一个酶分子内进行的交联反应，如果双功能试剂的行的交联反应，如果双功能试剂的2个功能团分别个功能团分别在在2个酶分子之间或在酶分子与其他分子之间进行个酶分子之间或在酶分子与其他分子之间进行交联，则可以使酶的水溶性降低，成为不交联，则可以使酶的水溶性降低，成为不 溶于水溶于水的固定化酶，谓之交联固定化。的固定化酶，谓之交联固定化。51第三节：肽链有限水解修饰第三节：肽链有限水解修饰n酶的催化功能主要决定于酶

28、的活性中心的构象，活性酶的催化功能主要决定于酶的活性中心的构象，活性中心部位的肽段对酶的催化作用是必不可少的，而活中心部位的肽段对酶的催化作用是必不可少的，而活性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。52 酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况中的一种：种情况中的一种：n若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将失去其催化功能；若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将失去其催化功能；n若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则酶的活力

29、仍可保持或损失不多；酶的活力仍可保持或损失不多；n若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活且形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高。力提高。在后两种情况下，利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发在后两种情况下，利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有生某些精细的改变，而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。限水解修饰。53N端端54a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白

30、白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶5556天门冬氨酸酶通过胰蛋白酶进行修饰，从其羧基末端水解切除10多个氨基酸残基的肽段，可使天门冬氨酸酶的催化效率提高45倍以上。57 若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性显著降低，在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性显著降低，甚至消失。甚至消失。n例如：将木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，例如：将木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，使其全部肽链的三分之二被水解除去，该酶的酶活力使其全部

31、肽链的三分之二被水解除去，该酶的酶活力保持不变，而其抗原性大大降低。保持不变，而其抗原性大大降低。n又如：酵母的烯醇化酶经有限水解除去由又如：酵母的烯醇化酶经有限水解除去由150个氨基个氨基酸组成的肽段后，酶活力仍可保持，抗原性却显著降酸组成的肽段后，酶活力仍可保持，抗原性却显著降低。低。58n对酶进行肽链有限水解，通常使用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂。此外也可采用其他方法使肽链部分水解，达到修饰目的。n例如，枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA处理，再经纯水或稀盐缓冲液透析，可使该酶部分水解，得到仍有蛋白酶活性的小分子肽段，用作消炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。59第四节：氨

32、基酸置换修饰第四节：氨基酸置换修饰 若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。换修饰。一、氨基酸置换修饰的作用提高酶催化效率：酪氨酸酪氨酸tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所对应合成酶可催化酪氨酸和其所对应tRNA合成酪氨酰合成酪氨酰tRNA，若将该酶第，若将该酶第51位的苏氨酸（位的苏氨酸（Thr51）由脯氨酸置换，修饰）由脯氨酸置换，修饰后的酶对后的酶对ATP的亲和性提高

33、近的亲和性提高近100倍，催化效率提高倍，催化效率提高25倍。倍。增强酶的稳定性 T4溶菌酶分子中第溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸位的异亮氨酸(ILu3）换成半胱氨酸后，）换成半胱氨酸后，该半胱氨酸该半胱氨酸(Cys3)可与第可与第97位的半胱氨酸位的半胱氨酸(Cys97)形成二硫形成二硫键，氨基酸置换修饰后的键，氨基酸置换修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。热的稳定性却大大提高。使酶的专一性发生改变二、氨基酸置换修饰的方法化学修饰法：化学修饰法：例如：例如：Bender和和kosland成功地利用化学方法将枯草杆菌成功地利用化学方

34、法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等对蛋白质和肽的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，底物水解的活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸多限制，难于工业化生产。受到诸多限制，难于工业化生产。定点突变技术：定点突变技术：（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质

35、工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。6364酶分子的定点突变酶分子的定点突变1 1、基因序列分析、基因序列分析2 2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3 3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4 4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5 5、酶基因克隆表达、酶基因克隆表达6 6、变异特性分析、变异特性分析第五节：酶分子的物理修饰n通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。可以了解在不同的物理条件下，特别是在极端

36、条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。还可能提高酶的催化活性，增强酶的稳定性或者是酶的催化动力学特性发生某些改变。例如：羧化酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利于催化肽的合成反应，而水解反应的能力降低；用高压方法处理纤维素酶以后该酶的最适温度有所降低，在30-40的条件下，高压修饰酶比天然酶的活力提高10。特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。67第六节 核苷酸链剪切修饰及置换修饰n在核苷酸的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，以改变酶的催化特性。这种方法称为核苷酸链剪切修饰（例如四膜虫26

37、SRNA前体经过经自我剪接形成成熟的多功能核酸类酶L-19IVS。n将酶分子核苷酸链的特定的核苷酸替换为另一个核苷酸，从而使酶的催化特性改变。这种方法称为核苷酸链置换修饰.置换修饰。核酸类酶：主要由核苷酸组成。第七节第七节 酶分子修饰的应用酶分子修饰的应用n在酶学研究方面的应用在酶学研究方面的应用n在医药方面的应用在医药方面的应用n在工业方面的应用在工业方面的应用n在抗体酶研究方面的应用在抗体酶研究方面的应用n在核酸类酶人工改造在核酸类酶人工改造n在有机介质酶催化反应中的应用在有机介质酶催化反应中的应用n从20世纪50年代开始，酶分子的侧链基团修饰已经成为生物化学和酶学研究的热门课题。主要用于

38、研究酶的结构与功能的关系。对酶学的发展作出了重要贡献。n在酶学研究方面的应用酶的活性中心研究酶的空间结构研究酶的作用机制研究 增强医药用酶的稳定性增强医药用酶的稳定性 T4溶菌酶分子中第溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸位的异亮氨酸(ILu3）换成半胱氨酸后，）换成半胱氨酸后，该半胱氨酸该半胱氨酸(Cys3)可与第可与第97位的半胱氨酸位的半胱氨酸(Cys97)形成二硫形成二硫键，氨基酸置换修饰后的键，氨基酸置换修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。对热的稳定性却大大提高。降低或消除酶抗原性降低或消除酶抗原性 具有抗癌作用的精氨酸酶经聚乙二

39、醇结合修饰，其具有抗癌作用的精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰，其抗原性被消除；抗原性被消除；对白血病有显著疗效的对白血病有显著疗效的L-L-天冬酰胺酶经聚乙二醇结天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，使抗原性显著降低甚至消除。合修饰后，使抗原性显著降低甚至消除。19941994年正式作为治年正式作为治疗急性淋巴性白血病的药物在临床使用。疗急性淋巴性白血病的药物在临床使用。n在医药方面的应用：n超氧化物歧化酶，经过大分子结合修饰，形成聚乙超氧化物歧化酶，经过大分子结合修饰，形成聚乙二醇二醇-超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（PEG-SOD），其稳定性显），其稳定性显著提高，在血浆中的半衰期可以延长著提高，在血

40、浆中的半衰期可以延长350倍。倍。n采用葡聚糖二乙醛对青霉素酰化酶进行分子内交联采用葡聚糖二乙醛对青霉素酰化酶进行分子内交联修饰，可以使该酶在修饰，可以使该酶在55条件下的半衰期延长条件下的半衰期延长9倍，倍，而其最大反应速度不改变。而其最大反应速度不改变。n用亚硝酸修饰用亚硝酸修饰L-天冬酰胺酶，使其氨基变成羟基。天冬酰胺酶，使其氨基变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，在体内的半衰经过修饰后，酶的稳定性大大提高，在体内的半衰期延长期延长2倍。倍。提高工业用酶的催化效率提高工业用酶的催化效率 采用大分子结合修饰，使每分子胰蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力可以达到原有酶活力的5.1倍。

41、n在工业方面的应用：在工业方面的应用：通过金属离子置换修饰，将杂离子型-淀粉酶全部置换为钙型-淀粉酶，其催酶化效率可以提高3倍以上，而且稳定性大大增加。故此，在-淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中，添加一定量的钙离子，有利于提高-淀粉酶的活力和稳定性。增强工业用酶的稳定性改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性经过琥珀酰化修饰后，葡萄糖异构酶的最适经过琥珀酰化修饰后，葡萄糖异构酶的最适pH值下降值下降0.5，并增强酶的稳定性，更加有利于果葡糖浆和果糖的生产。并增强酶的稳定性，更加有利于果葡糖浆和果糖的生产。n如果对酶分子进行侧链基团修饰，使酶分子表面的基团如果对酶分子进行侧链基团修饰，使酶分子表面

42、的基团增强疏水性，就可能使酶溶解于有机溶剂，均匀地分布增强疏水性，就可能使酶溶解于有机溶剂，均匀地分布于溶剂中，就有可能提高酶的催化效率和稳定性。于溶剂中，就有可能提高酶的催化效率和稳定性。n例如，采用单甲氧基聚乙二醇对脂肪酶、过氧化氢酶、例如，采用单甲氧基聚乙二醇对脂肪酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等酶分子表面上的氨基进行共价结合修饰，过氧化物酶等酶分子表面上的氨基进行共价结合修饰，得到的修饰酶能够均一地溶解于苯和氯仿等有机溶剂得到的修饰酶能够均一地溶解于苯和氯仿等有机溶剂中，并具有较高的催化活性和稳定性中，并具有较高的催化活性和稳定性。在有机介质酶催化反应中的应用在有机介质酶催化反应中的应用76n在抗体酶开发中的应用n在核酸类酶改造中的应用77作业n何谓金属离子修饰？如何进行金属离子修饰？n何谓大分子结合修饰，如何进行大分子结合修饰？