仪器分析色谱分析导论

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1、General Introduction to Separations and Chromatography,2020/9/24,College of Chemistry bonded phase has positive charge Cation analyte is cation; bonded phase has negative charge Partition - based on the relative solubility of analyte in mobile and stationary phases Normal analyte is nonpolar organic

2、; stationary phase MORE polar than the mobile phase Reverse analyte is polar organic; stationary phase LESS polar than the mobile phase Size Exclusion - stationary phase is a porous matrix; sieving,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,19,色谱流出曲线（色谱图）,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,2020/9/

3、24,College of Chemistry & Chemical Engineering,20,色 谱 术 语,1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大的、稳定的基线为水平直线。 2）峰高：色谱峰顶点与基线的距离。 3）保留值(Retention value, R),2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,21,a. 死时间(Dead time, t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速 与流动

4、相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 b. 保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,22,c. 调整保留时间 ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即 由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 d. 死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到： 其中，Fco为柱出口的

5、载气流速（mL/min)，其值为： F0-检测器出口流速；Tr-室温；Tc-柱温；p0-大气压；pw-室温时水蒸汽压。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,23,e. 保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 f. 调整保留体积 ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。 g. 相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,24,注意： r2,1只与柱温和固定相性质有

6、关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！ 具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值，此时以 表示： 1, 又称选择因子(Selectivity factor)。 h. 区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法： 标准偏差：0.607倍峰宽处的一半。 半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。 W= 4.,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Enginee

7、ring,25,色谱流出曲线的意义,色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否 合适的依据。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,26, 色谱法基本原理,两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。 每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定。 因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。 一、描述分配过程的参数 1

8、. 分配系数(Distribution constant, K)： 描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。 K 只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,27,2. 分配比(Retention factor or capacity factor, k),在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。 其中VmV0，Vs为固定相体积。 分配比 k 的

9、求算： 1）组分滞留因子： 2）又， 3）因此，,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,28,3. K 与 k 的关系： 称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=635；对毛细管柱， =60600。 4. 选择因子 ：色谱柱对A、B两组分的选择因子 定义如下： A为先流出的组分，B为后流出的组分。 注意：K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配；而 是反映两组分间的分离情况！当两组分 K 或 k 相同时， =1 时，两组分不能分开；当两组分 K 或 k 相差越大时， 越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相

10、间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。 和 k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,29,Example Chromatogram,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,30,二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述,1. 塔板理论（Plate theory) 1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但

11、它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。 塔板理论假定： 1）塔板之间不连续； 2）塔板之间无分子扩散； 3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次 平衡所需柱长为理论塔板高度H； 4）某组分在所有塔板上的分配系数相同； 5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积 加入。 当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,31,Chromatography Interpreting Theoretical Pl

12、ates,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,32,根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数： 可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。 若柱长为L，则每块理论塔板高度H为 由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。 但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff 和有效塔板高度Heff 表示：,2020/9/24,College of Che

13、mistry & Chemical Engineering,33,N for Asymmetric Bands,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,34,有关塔板理论的说明,1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等； 2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。 3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。 但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传

14、质的影响。因此它不能解释： 峰形为什么会扩张？ 影响柱效的动力学因素是什么？,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,35,2. 速率理论（Rate theory）,1956年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了van Deemter方程： u 为流动相线速度； A，B，C为常数，其中 A分别表示涡流扩散系数； B分子扩散系数； C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。 该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）

15、的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,36,1）涡流扩散项(Multipath term, A) 在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同峰形展宽。 展宽程度以A表示： A=2dp 其中dp填充物平均直径； 填充不规则因子。 可见，使用细粒的固定相并填充 均匀可减小A，提高柱效。对于 空心毛细管柱，无涡流扩散， 即A=0

16、。,流动方向,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,37,2）分子扩散项(Longitudinal diffusion term, B/u) 纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2D 称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况； D组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Eng

17、ineering,38,分子扩散项(B/u) B=2D 讨论： 分子量大的组分，Dg小，即B小 Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； 流动相分子量大，Dg 小，即 B 小； u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u） 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可忽略。,球状颗粒； 大分子量流动相； 适当增加流速； 短柱； 低温。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,39,3）传质阻力项(Mass-transfer term, Cu) 因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相

18、，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,40,传质阻力项(Mass-transfer term, Cu) a）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl,流动相,固液界面,固定液,组分分子,Cl,Cg,讨论： 减小填充颗粒直径dp； 采用分子量小的流动相，使Dg增加； 减小液膜厚度df，Cl下降。但此时k 又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。 增加柱温，可增

19、加Dl，但k值也减小，为保 持合适Cl值，应控制柱温。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,41,b）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。 讨论： 流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力Cs。分别与填充物大小 dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。 因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。 固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子 k 和扩散系数Ds等有关。 因此，降低固定相传

20、质阻力的方法有：与气液色谱中的表述相同。,sm,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,42,涡流扩散项A与流速u无关； 低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效； 高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如H2和He为载气， 可增加扩散系数，提高柱效； 曲线的最低点对应最佳线速uopt( ) 下的最小板高Hmin( )； LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在LC中，较低流速可获得较大的柱效。,4）流速u 由van D

21、eemter方程 H = A + B/u + Cu知道： 当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。 以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：,板高，H(cm),2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,43,5）固定相颗粒大小对板高的影响 实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采用细颗粒作固定相的理论根据！ 但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。 上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是如何从总体

22、上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？,板高, H(cm),2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,44, 分离度及色谱分离方程,Peak Broadening Solute tends to spread into Gaussian shape with standard deviation s. Common measures of breadth w1/2 and w. Longer on column leads to broader peak.,2020/9/24,College o

23、f Chemistry & Chemical Engineering,45,一、分离度(Resolution, R) 同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为： 利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。 R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,46,Resolution Example,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engi

24、neering,47,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,48,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,49,二、色谱分离方程,R 的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R 未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子 和保留因子 k 联系起来。 对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数 K 相差小，可合理假设k1k2=k，W1 W2=W。因此可导出R与n（neff）、 和 k 的关系：,2020/9/24,College of Chemistry &

25、Chemical Engineering,50,附：具体推导过程如下,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,51,有关色谱方程的讨论,1）分离度R与柱效的关系 分离度R与理论塔板数n有关，即R受热力学性质的影响。 对具一定相对保留值的物质对，R与有效塔板数neff有关，说明neff可正确代表柱效能。 由色谱方程可得： 因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。 2）分离度R与选择因子的关系 越大，柱选择性越好，对分离有利。 的微小变化可引起 R

26、较大改变。如，当 从1.01增加至1.10(增加9%)时，R 则增加 9 倍(但1.5, R增加不大) 。 改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。 3）分离度R与分配比k的关系 k增加，分离度R增加，但当k10，则R的增加不明显。通常k在210之间。 改变 k 的方法有：增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,52,70%CH3OH +30H2O,60%CH3OH +40H2O,50%CH3OH +50H2O,40%CH3OH +60H2O,溶

27、剂(流动相)组成对色谱分离的影响,1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌 4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；,改变组成使 k 最佳,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,53,色谱分离中的问题 由于分析物组成复杂，以某组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决这个问题。,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical En

28、gineering,54,三、分析时间 t,分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。 由以下三式： 得到 可见，分析时间与R，k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间则是原来的4倍。 实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,55,概念、表示方法及计算公式汇总,表-1,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,56,表-2,2020/9/24,College of Chemistry & Chemical Engineering,57,Summary,