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1、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction),根据细胞分裂中 DNA 半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。,PCR工作原理,以要扩增的DNA分子为模板， 以一对与模板5末端和3末端互补的寡核甘酸片段为引物 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下 依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。,体外(试管中)扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上,PCR技术 特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速,PCR体系基本组成,模板DNA： （102-5）拷贝 dNTP底物：2
2、0200umol/L 特异性引物： 0.10.5 umol/L DNA聚合酶：Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。 含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。,循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍,反应分三步：,1 变性 denaturation： 加热90-95，模板DNA双链解离形成单链DNA； 2 退火 annealling： 温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60,Tm值4
3、（G+C）+2（A+T）-5. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。 70-75时间-要扩增片段长度决定,待扩增片段：1000 bp 引物 Tm 55 DNA 模板变性: 94, 5分钟; PCR 循环 (30 次):94, 30秒; 50, 45秒; 72, 1分钟; 最终延伸: 72, 10分钟,PCR 反应条件的设定,PCR产物的检测,琼脂糖凝胶电泳； 分子杂交； 限制性内切酶酶切分析； 微孔板夹心杂交法； 直接测序,PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳,PCR 产物,PCR 产物,PCR 技术的应用 1. 基
4、础研究 (1) 基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核 苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。 (2) 基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。 2. 医学 (1) 感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。 (2) 遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 (3) 恶性肿瘤的诊断 3. 基因动、植物的检测 (1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。,PCR新技术,RT-PCR：用于RNA分析 梯度PCR：可用于找出最适合的退火温度 反向PCR：可对未知
5、序列扩增后进行分析 不对称PCR：用于制备单链DNA 多重PCR：加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段 降落PCR：用于PCR条件的优化，避免非特异性序列的扩增 实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 巢式PCR：使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段,反转录 PCR (RT-PCR) RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。,5,3,AAAAA,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,RT-PCR 原理,mRNA,1st cDNA,逆转录酶、下游
6、引物、dNTPs,Taq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs,5,5,3,3,特异 PCR 产物,5,5,3,3,经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝,5,5,3,3,一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在同一个试管中进行。 两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在不同的试管中进行。,下游引物 特异性引物 Oligo(dT),降落PCR（ Touchdown PCR ）用来避免非特异性序列的扩增,PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性
7、产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。,反向PCR (Inverse PCR, IPCR),扩增引物相反方向DNA序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有
8、切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。,1. 用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶 消化大分子量的DNA2. 产生的大小不同的线性DNA片段群体，其中具靶DNA区段的DNA分子长度不超过2-3Kb,经连接后环化成环状分子 3. 按靶序列设计的一对向外引物同靶序列5，-端互补序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指 4.
9、经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制酶的识别位点,不对称PCR（ asymmetric PCR ）：用于制备单链DNA,PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的1%（或2%）。 经过PCR循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继续引导DNA合成。 这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。,多重PCR,一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的
10、鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。,梯度PCR（Gradient PCR）,是指我们在摸PCR条件的时候采取的一种手段，因为不能确认引物的最佳退火温度，会采用梯度PCR，同时在不改变其他PCR条件的情况下，对目的基因使用不同的退火温度，最终找到一个适合目的基因的退火温度。在这里，每个PCR反应管只有一个退火温度。,实时荧光定量P
11、CR技术,实现了PCR从定性到定量的飞跃,实时荧光定量PCR原理,指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 特异性更强、 有效解决PCR污染、 自动化程度高、 实时监测反应过程,Ct 值的定义,在荧光定量PCR技术中重要概念 Ct值 C代表Cycle，t代表threshold，Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数,Ct值与起始模板的关系,每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。只要
12、获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。,巢式PCR（Nested PCR ）,巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异 。 巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。,谢谢,
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