LENTI EGFP
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1、2、Lenti-EGFP大包:一 实验目的将目的基因慢病毒表达载体与包装质粒共转293T细胞,进行目的基因的慢病毒包装。二 实验材料1 细胞株:293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,培养基为DMEM+10% FBS+1% P/S+1%Glutamax。2 质粒载体:目的基因过表达慢病毒表达载体Lenti-IRES-EGFP;慢病毒包装质粒Mix(Gag-pol、Vsvg、Rev); 三 实验步骤1 质粒准备:1. 将测序正确的Lenti-IRES-EGFP菌液划线培养,挑单克隆接入30ml 含Amp的LB,30摇过夜。用AXYGEN质粒中抽试剂盒进行质粒抽提,具体操作详见说明书
2、。2. 测定质粒浓度:质粒DNA 最终溶于除菌的TE 中,以Thermo Nanodrop仪器测定质粒浓度及纯度,保证抽提质粒的浓度在1ug/ul左右,DNA的A260/A280 在1.82.0 之间。2 细胞准备:1. 转染前一天,取生长状态良好的293T细胞,弃旧培养液,加入 3 ml PBS 溶液,轻轻晃动,洗涤细胞生长面,然后弃去PBS溶液。2. 每皿加入2 ml 胰酶消化液,消化约2 min 直到细胞收缩、变圆,吸弃胰酶,加入3ml DMEM+ 10% FBS培养基,用枪吹打数次,将皿底的细胞冲洗下来,重悬均匀。3. 按1:5的比例传至(PDL)包被的10cm皿中(共15皿),7 m
3、l DMEM+ 10% FBS, 37 、5% CO2细胞培养箱中继续培养约24h。3. 慢病毒包装1. 转染当天,观察细胞状态,细胞状态良好,贴壁牢,密度在50-70%时即可用于转染。2. 转染时,向无菌的50ml离心管中加入22.5ml Opti-MEM(1.5ml/皿15皿),加入表达质粒90ug(6ug/皿15皿)和包装质粒Packaging Mix 90ug(6ug/皿15皿),混匀,室温下温育5min。3. 向另一无菌的50ml离心管中加入22.5ml Opti-MEM(1.5ml/皿15皿),加入POLO 3000360ul(24ul/皿15皿) ,轻轻混匀,室温下温育5 分钟。
4、4. 把稀释后的DNA 与稀释后的POLO3000混合,轻轻地颠倒混匀,室温下孵育20 分钟,以形成DNA 与POLO3000 的复合物。5. 取3ml 上述混合液均匀地滴加在293T 细胞的培养液中,前后左右摇匀,于37 , 5% CO2细胞培养箱中培养。4、 病毒收获与浓缩1. 转染后48小时,收集293T 细胞上清液(第一次收液),4 暂存。2. 细胞更换新鲜的完全培养基,继续培养至72h,收集病毒上清(第二次收液)将两次混合。3. 于 4 ,3000 rpm 离心10 min,除去细胞碎片。4. 以 0.45 m 醋酸纤维素膜的滤器过滤上清液于病毒浓缩管中。5. 每管装36ml病毒,4
5、C 22000rpm 离心2h。6. 离心完毕后,小心取出离心管,弃上清,每管用100ul预冷的DMEM洗涤。待病毒沉淀溶解完全后收集至1.5ml EP管内后,100ul/管分装,-80C保存。5. 慢病毒滴度测定(荧光显微镜观察法)1) 感染前一天,用胰酶消化细胞并计数, 准备510 5细胞/ml 的293T细胞接种24孔板,每孔0.5ml。2) 细胞接种后第二天,根据病毒的预期滴度,准备3个无菌的EP管,10倍倍比稀释慢病毒浓缩液。20ul 慢病毒原液 + 180 ul DMEM 10 -1 病毒液20ul 10 -1 病毒液 + 180 ul DMEM 10 -2 病毒液20ul 10
6、-2 病毒液 + 180 ul DMEM 10 -3 病毒液20ul 10 -3 病毒液+ 180ul DMEM 10 -4 病毒液3) 细胞换液,每孔内加入500ul无抗生素的DMEM+10%FBS培养液,除control组外其余各孔均加入polybrene至终浓度为6 ug/ml。4) 各感染孔内分别加入相应稀释度的病毒液及病毒原液100ul,放入37、5% CO2的培养箱内。5) 感染24小时后,换液,每孔内加入500ul DMEM+10% FBS+1% P/S+1%Glutamax,继续放回培养箱内进行孵育。6) 感染72h后观察荧光表达情况,选取合适的稀释度对应的孔,对GFP阳性的细
7、胞进行计数,并依此计算待测慢病毒的滴度。7) 计算滴度: 计算感染形成单位(ifu/ml):(平均阳性细胞数/视野)(视野数/孔)病毒体积(ml)稀释倍数因为在10倍镜下观察,24孔板(10*目镜,10*物镜)为52,加入病毒体积为0.1ml. EGFP 10-1 G EGFP 10-1 W EGFP 10-1 G EGFP 10-1 W EGFP 10-2 G EGFP 10-2 W EGFP 10-3 G EGFP 10-3 W EGFP 10-4 G EGFP 10-4 B. 滴度计算:0倍物镜10倍目镜下,10-3孔内各随机选取视野,其GFP阳性细胞数为73所以每孔感染单位为(ifu/ml)为2.9*107
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