PAGE,SDSPAGE电泳分离

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1、2005/20062005/2006华南师范大学生命科学学院 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。极移动的过程称为电泳。不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。度也不同，从而得到分离。颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类 在电场中，颗粒的泳在电场中，颗粒的泳(移移)动速度通常用迁移

2、率来表示。动速度通常用迁移率来表示。迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度 球型较快球型较快,泳动速度越快泳动速度越快 溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶液的离子强度为溶液的离子强度为0.02-0.20.02-0.2 酶的纯度鉴定（分析电泳）酶的纯度鉴定（分析电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的形成 丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)光和

3、化学核黄素四 聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作用分离胶:起分离蛋白的作用,丙烯酰胺浓度可以是相同的(均一胶),也可以是不同的(梯度胶)分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成从低到高的连续梯度,一般是4%-20%分辨率高可连续上样电泳时间长可消除电荷对迁移率的影响 需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室 用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以溴酚蓝为指示染料 最常用 可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI4.0的蛋白均适用分析蛋白酶的纯度分析蛋白酶的纯度蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状大小，电荷和

4、形状有关，凝胶兼有分子筛的功能电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开一条带表明纯度高（电泳纯）蛋白酶的净电荷量蛋白酶的净电荷量蛋白酶电场强度溶液pH值离子强度电渗全酶分子量的对数全酶分子量的对数(Log M(Log Mr r)和泳动距离成反比和泳动距离成反比如果蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要注意有些杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动方向不同蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可靠!在十二烷基硫酸钠在十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)存在的条件下所作存在的条件下所作的聚

5、丙烯酰胺凝胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为称为SDS-SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称胺凝胶电泳，简称SDS-PAGESDS-PAGE巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原1g蛋白和1.4g SDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS带大量的负电荷SDS破坏蛋白质的非共价键 各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率只取决于胶束(亚基M Mr r)大小使含有亚基的蛋白质解离为各个亚基 测定蛋白亚基Mr研究蛋白纯度可结合PAGE、HPLC、IEF等研究蛋亚基组成分辨率高(如果是梯度胶)方便易行是蛋白组学研究的核心技术精确度高(测定误差不超过10%)SDS负电荷量远高于蛋白的电荷量，不同蛋白

6、之间的蛋白-SDS胶束的电荷是近似的蛋白-SDS胶束均为椭圆形,蛋白之间的胶束的分的分子形状是子形状是近似的 蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4同一蛋白能以不同的比例和SDS结合蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合糖蛋白:糖蛋白的糖基会形成空间位阻,亚基Mr的对数与其电泳迁泳率不成线性关系蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基,所测亚基Mr会偏高含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr可能测不准碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE所测亚基Mr偏高组蛋白亚基Mr为21kD，但测定出为35kD

7、 组蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷铁氧还蛋白的亚基Mr只有8kD，但Rf=0.8铁氧还蛋白不能和SDS充分结合强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀可能是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几磷酸化前后的蛋白激酶其构象会发生改变，妨碍了蛋白和SDS的结合SDS-PAGE中所测亚基Mr会偏高经磷酸化后，会使激酶的负电荷增加，同一钙调蛋白可以不同比例和同一钙调蛋白可以不同比例和SDSSDS结合结合 不同不同Ca2+Ca2+浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同 疏水性质不同导致和疏水性质不同导致和SDS结合的比例不同 导致钙调蛋白有不同的大小导致钙调蛋白有不同的大小铁氧

8、还蛋白和钙调蛋白是酸性蛋白，无论是否和SDS结合和结合程度如何，在碱性电泳系统的SDS-PAGE中均向负极泳动，只是迁移率不同而已如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到达不到1:1.4,1:1.4,它就可能向负极泳动。碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样会向负极泳动菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极菜心(A)和生菜(B)绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极ABTable Amino acid contents of cathode

9、buffer after crude protein from B.Table Amino acid contents of cathode buffer after crude protein from B.ssp.ssp.var.var.leaves was subjected to SDS-PAGEleaves was subjected to SDS-PAGEPhe 57.05 Lys 10.15Phe 57.05 Lys 10.15见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的碱性蛋白的测定.热带亚热带植物学报,2006,14（2）：126-129 Fig

10、.SDS-denatured glycolate oxidase from was subjected to SDS-PAGE(A),CE(B)and acetate cellulose membrane electrophoresis(C).The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample TableTable Amino acid contents Amino acid contents of cathode buffer after partially purifiedof cath

11、ode buffer after partially purified glycolate oxidase Leu 2.89 2.89 1.66 Tyr 1.48 1.90 2.10Leu 2.89 2.89 1.66 Tyr 1.48 1.90 2.10见:曾秋莲等.植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋白的发现.中国生物化学与分子生物学报,2006,22(1):86-90很多蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。猪生长激素经SDS-PAGE后只有

12、28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另一个亚基则在SDS-PAGE中是向负极泳动，因而被忽视 等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在等电聚焦电泳简称为等电聚焦。是在19661966年成功地合成载年成功地合成载体两性电解质以后才发展起来的电泳技术体两性电解质以后才发展起来的电泳技术 在电泳系统中加入两性电解质载体，通电后，载体两性电解质即在电场中形成一个由负极到正极连续变化的pH梯度 当蛋白质,酶或多肽进入这个pH梯度时，不同的蛋白质会不断地泳动,直至到达(聚焦)与其pI相当的pH位置上 用于分离具有不同pI的蛋白和测定蛋白的pI

13、 分离仅仅决定于蛋白质的pI。电泳中区带越来越窄，克服了其他电泳中存在的扩散作用。一旦蛋白质到达它的等电点位置，它就没有净电荷，蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带样品加样位置无关不管样品加在什么部位，都可以聚焦到与其等电点相当的pH的位置很稀的样品都可分离，而且重现性好 可将pI仅相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开 用用IEFIEF离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的离蛋白质，必须要有一个稳定的和线性的pHpH梯度梯度早期发现谷氨酸，组氨酸或赖氨酸能产生大约1pH的梯度但pH范围太窄，且缓冲能力不够蛋白质分子本身也是两性电解质，在电泳时，它会影响梯度的pH在等电点状态下

14、有足够的导电能力，而且各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整个体系中电导均匀两性电解质的紫外吸收低,以便IEF后的检测以便在IEF后两性电解质不干扰蛋白的检测分子量要小,以便在IEF后易于分开蛋白和两性电解质 与样品中各组分不会发生相互作用无生物学效应 不干扰酶活性测定 不干扰免疫检测不干扰抗体制备(注射到小白鼠或大白兔中)两性电解质的合成不饱和酸(丙烯酸)与多乙烯多胺(五乙烯六胺)发生双健的加成反应而成调节酸和胺的比例，就可得到一系列的氨基与羧基不同比例的多氨基多羧酸可得到不同pH范围的载体两性电解质如pH 3-10;pH 3.5-5;pH 5-7;pH 6-8;pH 9-11当引入电场，两性电解质分子将向正极或负极迁移在电场下,所有的一系列的氨基/羧基比例不同的两性电解质分子（脂肪族多氨基多羧酸），最终到达其pI相同的位置短时间内在正、负极之间给出一个pH梯度