《超临界色谱》PPT课件.ppt

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1、4-5 超临界流体色谱法简介,超临界流体色谱法 （Supercritical Fluid Chromatography ,SFC）是以超临 界流体作为流动相的一种色谱方法。 所谓超临界流体，是指既不是气体 也不是液体的一些物质，它们的物 理性质介于气体和液体之间。,超临界流体色谱技术是2O世纪80年 代发展起来的一种崭新的色谱技术。 由于它具有气相和液相所没有的优点， 并能分离和分析气相和液相色谱不能 解决的一些对象，应用广泛，发展十 分迅速。,据Chester估计，至今约有全部分 离的25涉及难以对付的物质，通过 超临界流体色谱能取得较为满意的结 果。,1超临界流体的特性,(1) 物质的临界

2、点 我们知道，某些纯物质具有三相点和临界点。纯物质的相图见图4-s1由三相图看出：物质在三相点下，气、液、固三态处于平衡状态。而在物质的超临界温度下，其气相和液相具有相同的密度。当处于临界温度以上，则不管施加多大压力，气体也不会液化。,在临界温度和临界压力以上，物质 是以超临界流体状态存在。即在超临界 状态下，随温度、压力的升降，流体的 密度会变化。此时的物质既不是气体也 不是液体，却始终保持为流体。临界温 度通常高于物质的沸点和三相点。,（2）超临界流体的特性 超临界流体具有对于分离极其有利的物理性质。它们的这些性质恰好介于气体和液体之间。超临界流体的扩散系数和粘度接近于气相色谱，因此溶质的

3、传质阻力小，可以获得快速高效分离。另一方面，其密度与液相色谱类似，这样就便于在较低温度下分离和分析热不稳定性、相对分子质量大的物质。,另外，超临界流体的物理性质和 化学性质，如扩散、粘度和溶剂力等， 都是密度的函数。因此，只要改变流体 的密度，就可以改变流体的性质，从类 似气体到类似液体，无需通过气液平衡 曲线。超临界流体色谱中的程序升密度 相当于气相色谱中程序升温度和液相色 谱中的梯度淋洗。,通常作为超临界流体色谱流动相的一些物质，其物理性质列在表4-1中。,2超临界流体色谱仪,1985年出现第一台商品型的超临 界流体色谱仪。图4-s6表示了超临界 流体色谱仪的一般流程。 图中很多部分类似于

4、高效液相 色谱仪， 但有两点重要差别：,（l）具有一根恒温的色谱柱。这点 类似气相色谱中的色谱柱，目的是为了 提供对流 动相的精确温度控制。 （2）带有一个限流器（或称反压 装置）。目的用以对柱维持一个合适的 压力，并且通过它使流体转换为气体后， 进入检测器进行测量。实际上，可把限 流器看作柱末端延伸 部分,3压力效应,在SCF中，压力的变化对容量因 子k产生显著影响，由于以超流体作为 流动相，它的密度随压力增加而增加， 而密度的增加引起流动相溶剂效率的 提高，同时可缩短淋 洗时间。,例如，采用CO2流体作流动相，当压 力由7.O106Pa增加到90106Pa时， 对于十六碳烷烃的淋洗时间可由

5、25min 缩短到5min。在SFC中，通过程序升压 实现了流体的程序升密，达到改善分离 的目的。,4.固定相和流动相,用于SFC中的色谱柱可以是填充柱 也可以是毛细管柱，目前，毛细管超临 界流体色谱（CSFC）由于具有特别高的 分离效率，倍受人们的青睐。,在SFC中，最广泛使用的流动相要 算是 CO2流体，它无色、无味、无毒、 易获取并且价廉，对各类有机分子都是 一种极好的溶剂。它在紫外区是透明的； 临界温度31，临界压力7.29106Pa； 在色谱分离中，CO2流体允许对温度、 压力有宽的选择范围。,有时可在流体中引入1%10%甲醇， 以改进分离的选择因子值。除CO2流 体外，可作流动相的

6、还有乙烷、戊烷、 氨、氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙基 醚和四氢呋喃等。,5.检测器,在高效液相色谱仪中经常采用的检测器，如紫外、荧光、火焰光度等都能在SFC仪中很好应用。但SFC比起HPLC还具有一个主要优点是可采用GC中火焰离子化检测器（FID）。我们知道，FID对一般有机物分析具有较高的灵敏度，这也就提高了SFC对有机物测定的灵敏.,6超临界流体色谱法与其他色谱法比较,（l）与高效液相色谱法比较 实验 证明SFC法的柱效一般比HPLC法要高： 当平均线速度为0.6cmS-1时，SFC 法 的柱效可为 HPLC 法的3倍左右，在最 小板高下载气线速度是4倍左右；因此 SFC 法的分离时间也比

7、 HPLC 法短。 这是由于流体的低粘度使其流动速度 比 HPLC 法快，有利于缩短分离时间。,（2）与气相色谱法比较 出于流体 的扩散系数与粘度介于气体和液体之 间，因此SFC的谱带展宽比GC要小； 另外，SFC中流动相的作用类似LC中 流动相，流体作流动相不仅载带溶质 移动，而且与溶质会产生相互作用力， 参与选择竞争。,还有，如果我们把溶质分子溶 解在超临界流体看作类似于挥发， 这样，大分子物质的分压很大， 因此可应用比GC低得多的温度， 实现对大分子物质、热不稳定性 化合物、高聚物等的有效分离。,（3）应用范围的比较 图20-s7描绘 了SFC与其他色谱方法测定相对分子 质量范围的比较。

8、由图20-s7看出SFC 比起GC法测定相对分子质量的范围 要大出好几个数量级，基本与LC法 相当。,当然，尺寸排阻色谱法（SEC） 所测分子质量范围是所有色谱法中最 大的。超临界流体色谱法被广泛应用 于天然物、药物、表面活性剂、高聚 物、多聚物、农药、炸药和火箭推进 剂等物质的分离和分析。,4-6 毛细管电泳 capillary electrophoresis,4-1概述 早在一百多年以前，较原始的电泳实验，是在一个U形一管中进行的，管中盛有溶液，两端置有电极，加上几百伏电压后，首次实验了对毒素和抗毒素的分离。1909年，L.Michaelis提出“电泳”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的

9、等电点。,此后，许多的研究报告涉及氨基 酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电 泳完成了的溶液中，再次发生对流混合， 曾使用了各种稳定介质，如琼脂、纤维 粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺；,为了防止热扩散而使用了一种内径 小的管道，管道内径由3mm缩小至75m。 1981年，Jorgenson.和 Lukacs 使用 75m内径的熔融石英毛细管，电泳分 离氨基酸和肽。至此，出现了毛细管电 泳（capillary electrophoresis，CE） 技术。,毛细管电泳，又称高效毛细管电泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE），它不同于经典的区

10、带电泳，有如下特点：,（1）它是在内径（1O200）m的石 英毛细管中进行的，在毛细管中的散热 较好，沿着管截面的温度梯度很小，因 此，可以提高加在毛细管两端的电压， 所加电压可高达几十千伏。,（2）它不需要阻流介质，但可使用 凝胶作分子筛介质。 （3）可使用在柱检测法，缩短分析时间， 结合计算机处理数据，可实现自动化操 作。 （4）灵敏度高，检测眼可达（10-13 10-15）mol，使用激光诱导的荧光检测 限可达（10-1910-21）mol。,（5）分辨率高，理论塔板数为几十万 至几百万米。 （6）取样量少，有时只需几个纳升 （nL，10-9L），流动相只需几毫升。,4-1 高效毛细管由

11、泳的基本原理,1.溶质在毛细管区带电泳过程中的传递 含离子的溶液，在电场中所发生的物 理过程服从欧姆定律，当有直流电通过溶 液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极 迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其 迁移率(又称淌度，即指溶质在单位时间 和单位电场强度下移动的距离)。离子迁 移率以表示，其大小受溶质的电荷离 子大小比例所控制。,在电场的影响下，带电荷的质 点受到的力Fe，等于其净电荷q与 电场强度E的乘积，即Fe = qE。 电场强度E以每单位长度所加的电 压U来表示，即E=U/L，其中L是毛 细管长度。Fe对正电荷为正值，对 负电行为负值。,电场力促使带电质点向两极移动， 质点在移动过程中，

12、也受到一种与电 场力方向相反的阻滞力Fd，阻止其 移动，此阻滞力与质点的电泳速度 成正比，由下式结出,Fd =f 式中，f是质点平移动所受的摩擦 阻力，对小的球状物质点，可用斯托克 斯（Stokes）定律表示，即： f=6r,式中，是溶液的粘度，r是离子半 径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质 点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻 力，一种带电质点在电场中运动，被加 速到一有限速度，此速度取决于Fe和Fd， 这一有限速度称为电泳速度，ep 。当 促进力与阻滞力达到平衡时，则,ep qEf 将上述表达式合并，作为电泳迁 移率（或电泳淌度）ep 。表示式， 则 epepEq士6r 电泳迁移率定义为：一

13、种质点在 每单位电场强度下的稳态速度。,ep 值的大小，取决于分子的净电 荷数及其摩擦性质，（分子大小和形状） 以及所用介质的介电常数和粘度。 因而，对于每一种质点，在电场作用下 的迁移均具有特定的速度。 对于大分子或胶体，其关系可表示为,式中，是带电质点的Zeta电位； 为溶液的介电常数；K是德拜一修格 尔常数； 为离子半径；参数fK 是一个常数；其值在115之间，取 决于迁移质点的形状。,HPCE分离，几乎都是在熔融石 英毛细管中完成的，熔融石英是一种 高度交联的SiO2聚合物，具有很好的 抗拉强度。石英毛细管表面含有许多 硅酸基：）SiOH，在一定的条件下 可离解。使表面带有负电荷。,由

14、于表面带负电，因此，带负电荷 的离子被表面排斥，而带正电均离子则 被毛细管壁吸引，如图41所示 在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶 液中的阳离子在石英一溶液界面上形成 双电层。由于静电场的作用，靠近表面 的那些抗衡离子是不迁移的，因此构成 所谓稠密层。,由于热运动关系，离表面远的 离子构成可迁移层或扩散层，因为在 双电层内离子的立体分布，就形成一 种电势梯度.,当在毛细管两端加有电场时；扩散 层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于 离子是被水化的，因此，在缓冲液中的 液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极 移动，形成一种液流，称之为电渗流 （electroosmotic flow，EOF），它是一 种电

15、泳驱动力。,在双电层内，EOF总是向双电层内抗 衡离子方向迁移，穿过双电层的电势下 降的程度受电渗流速度所控制。电渗流 的线速度eo ，可以定义为：,式中，eo是电渗迁移率，即在单位电场强度下，电渗流的线速度。,Zeta电势可表示为： =4/ 式中，是毛细管表面电荷密度；为 双电层厚度。按近代电解质理论，等 于1K，因此式可写为：,式中，K为德拜一修格尔参数,4-2 在CZE分离中的迁移时间、效率及分辨率,在电渗流存在下，离子的迁移速度可表示为： =（eo）U/Lt 式中，Ld是毛细管总长度；U是外加电压。离子的迁移时间为t，则 t=LtLd/（eo）U 式中，Lt为进样端到检测器之间的毛细管

16、长度，或称为迁移长度。分离效率n可表示为,式中，D为溶质的平均扩散系数。由上式可见，如 果热影响阿忽略不计的话，增大电压，可增加分离效 率。,按Gidding方程5，分辨率R只可定义为,式中，是两溶质的区带间的相对速度差。对上面的公式处理，可得,1和2两溶质的电泳迁移率，而是它们的平均电泳迁移率。,在许多情况下，电渗流速度比许多质点的电泳速度要快，因此，在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移，不管它们带多少正电荷，都将先被检出，继之中性质点被检出，最后带负电荷的质点被检出。如图42所示。,4-3 HPCE仪器的基本结构,HPCE仪器的基本结构如图43所 示。充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入 盛有缓冲液的储瓶中，之后通以3OkV的 电压，整个带电管路置于一个安全保护盒 内以防高压危险，打开有机玻璃盒时即自 动切断电源。,待测组分从毛细管的一端引人，在 电场作用下，由于离子迁移速度有差别， 而在整个毛细管内形成不同的样品区带， 在毛细管的另一端放置检测器，以便连 续地检测流过的每一个组分带，分析信 号通过检狈u器接收后。经放大再输入计 算机系统进行数据处理与储存。,