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1、间接凝集反应,信阳职业技术学院 药学与检验系,间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应或被动凝集反应。,一、载体的种类及处理方法,常用载体有：红细胞（O型人红细胞，绵羊红细胞）、聚苯乙烯胶乳颗粒、明胶颗粒、离子交换树脂、活性炭、火棉胶等。 处理方法：颗粒表面的处理（醛化、鞣化、化学处理）,二、间接凝集反应的类型：,1.（正向间接凝集反应） 2. 反向间接凝集反应 3. 间接凝集抑制反应 4. 协同凝集反应,1（正向）间接凝集反应,用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体（图1
2、5-1）。,2反向间接凝集反应,用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。,3间接凝集抑制反应,诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。,间接凝集抑制反应原理示意图,4协同凝集反应,协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此
3、当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。,二、间接血凝试验,血凝试验是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验，在临床检验中应用广泛，其操作过程如下：,1.载体,红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用23天。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略
4、有增大，两面突起呈圆盘状。,醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60加热，并可反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。,2.致敏,致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持良好的免疫活性。 用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只须在低pH，低离子浓度下，用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺和氯化铬。,3.血凝试验,可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1:64，同时设不含标本的稀释
5、液对照孔。在含稀释标本1滴的板孔（或试管）中，加入0.5致敏红细胞悬液1滴，充分混匀，置室温12小时，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集（）。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱（图15-4），以凝集的孔为滴度终点。,血凝反应强度示意图,三、胶乳凝集试验,胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验，所用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8m大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子，但这种结合牢固性差。也可制备成具有化学活性基团的颗粒，如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等，抗原或抗体以共价键交联在胶乳表面。化学交联一般通过缩合剂碳化二亚胺
6、将胶乳上的羧基与被交联物上的氨基缩合在一起。这种用交联致敏的胶乳试剂性能稳定，保存期长。,四、间接凝集反应的应用,间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广为应用。,（一）抗原的检测,反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。 间接凝集反应的敏感度虽较沉淀反应高，但低于新发展的各种标记免疫测定。 例如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的间接血凝试验敏感度一般在25ng/ml，对献血员的筛检已不符合要求。,（二）抗体的检测,可用于检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体。 例如间接血凝试验或明胶颗
7、粒凝集试验用于检测抗人免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O等。也有用于检测自身免疫性疾病的抗体，例如类风湿因子胶乳凝集试验、抗DNA抗体和抗甲状腺球蛋白抗体的间接血凝试验等。,第四节 自身红细胞凝集试验,自身红细胞凝集试验（autologous red cell agglutination assay）与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为抗人O型红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与不论何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用
8、于检测标本中的抗体。 反应中的标本为受检者的全血。,自身红细胞凝集试验原理示意图,自身红细胞凝集试验的特点是受检标本为全血，不需分离血清，采指血或耳垂血进行试验，受检者即刻可知检测结果。此试验已成功地用于抗HIV抗体的检测。也有检测HBsAg的试剂供应，其敏感度与间接血凝试验相仿。,第五节 抗球蛋白参与的血凝试验,抗球蛋白参与的血凝试验由Coombs于1945年建立，故又称为Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。所谓不完全抗体，多半是7S的IgG类抗体，能与相应的抗原牢固结合，但在一般条件下不出现可见反应。Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结
9、合的特异抗体，使红细胞凝集。 经常用作试验的有两类方法。,（一）直接Coombs试验,将含球蛋白的试剂直接加到红细胞表面结合抗体的细胞悬液中，即可见细胞凝集可用玻片法定性测定，也可用试管法作半定量分析。常用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源性溶血性疾病等的检测。,直接Coombs试验,（二）间接Coombs试验,用以检测游离的血清中的不完全抗体。将受检血清和具有待测不完全抗体相应抗原性的红细胞相结合。再加入抗球蛋白抗体就可出现可见的红细胞凝集（图15-7）。此试验多用于检测母体Rh（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。,间接Coombs试验,
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