《理学生科实验》PPT课件.ppt

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1、微生物学实验,微生物与免疫学教研室,实验室规则及实验报告的书写,一、实验室规则及注意事项 进实验室必须穿好工作服，离室时脱下反折。非必需物品不要带入实验室。 用过的有菌器材要投入消毒缸，不得放在桌上，亦不可冲洗于水槽内。用过的玻片也应放于含消毒液的器皿内。 爱护公物，节约使用实验材料。实验完毕后，整理桌面，需培养的物品要放入培养箱。做好实验室清洁，关好水电等，洗手后离室。,实验过程中如发生意外，应进行紧急处理。 皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水或生理盐水冲洗后，涂以2%碘酒。小伤口用创口贴，大的戴手套（到老师处拿）。另建议同学们不要戴戒指，自我保护。 灼伤：涂以凡士林油、5%鞣酸。 菌液进入口腔

2、：应立即吐出，以大量清水漱口，必要时，根据菌类不同服用相关药物进行预防。 菌液流洒桌面：立即报告，以抹布浸沾2%-3%来苏儿后，盖在污染部位半小时方可抹去。若手上沾有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再以肥皂水洗。,二、实验报告的书写,目的和要求 实验原理 材料和试剂 步骤和方法 结果和讨论 思考题,实验一 培养基的配制及消毒灭菌,一、目的要求 1. 掌握配制培养基的一般方法和步骤 2. 了解常用的培养基及其作用 3. 掌握消毒，灭菌，防腐，无菌的概念 4. 掌握高压灭菌的原理以及使用方法 5. 熟悉其他消毒、灭菌的方法以及原理,二、实验内容及原理,第一部分 基础培养基的制备 一、培养基：

3、是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH 调到合适的范围。,培养基营养六要素,碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的营养物质。用途：糖、蛋白质、核酸合成。 氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的营养物质。用途：蛋白质、核酸合成。 能源：提供微生物生命活动最初能量来源的营养物或辐射能。 生长素：微生物生长必需，但又不能自行合成的有机物。 无机盐：提供微生物繁殖所需各种重要元素。 水分：水是保证生命活动重要的介质。,培养基的分类,根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以按以下方

4、式： 1、按成分的不同分 2、按培养基的物理状态分 3、按培养基的用途分,1、按照培养基的成分来分,天然培养基 合成培养基 半合成培养基,天然培养基,主要成分是复杂的天然有机物质，是实验室和发酵工厂常用的培养基。 主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。 营养全面丰富，使用微生物的生长，来源广泛，价格低廉,具体成分不清楚或不恒定。,合成培养基,用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，因此也称化学成分明确的培养基。一般用于研究微生物的形态，营养代谢，分类鉴定，育种选育，遗传分析。,半合成培养基,在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适

5、当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。,2、按照培养基的物理状态,固体培养基 半固体培养基 液体培养基,固体培养基,在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。一般加入1.5%2.0%即可（一般为1.8%）。 主要用于微生物的分离，鉴定，活菌计数，菌种保藏等。 固体培养基倒入平皿或者试管中，制成平板或者斜面。,半固体培养基,在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基。例如用琼脂做凝固剂时只需要加入0.2%0.7%（一般加入0.5%） 此种培养基常用来观察细菌的运动特征、菌种保存和噬菌体的分离纯化及制备等。,液体培养基,不含任何凝固

6、剂，配好后成液体状态的培养基。 广泛用于微生物的培养，生理生化代谢和遗传学的研究以及工业发酵等。,一、理想的凝固剂 不被培养的微生物分解利用 在微生物生长的温度范围保持固体状态 凝固点温度不能太低 对所培养的微生物无毒害作用 凝固剂在灭菌过程中不易被破坏 透明度好，粘着力强 配制方便且价格低廉,凝固剂,二、常用的凝固剂 1、常用： 琼脂、琼脂糖、明胶、硅胶等 2.实验室中最常用： 琼脂：凝固点40，熔点：96 ,3、按照培养基的用途分,基础培养基 营养培养基（加富培养基） 鉴别培养基 选择培养基,基础培养基,含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白

7、胨培养基。 这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。,营养培养基（加富培养基）,在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清、动物（或植物）组织液，酵母浸膏或生长因子。 用以培养对营养要求苛刻的微生物。,鉴别培养基,是一类含有特定化合物或试剂的培养基。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。 主要用于不同类型微生物的生理生化鉴定。,选择培养基,利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离

8、或鉴别某种微生物的目的。,本次试验内容,1、配制牛肉膏蛋白胨培养基 2、配制固体、半固体、液体培养基 3、消毒灭菌 4、平皿、移液管、锥形瓶等的包扎,三、实验器材 量筒、小试管、中试管、试管帽、移液管、500mL锥形瓶、玻璃棒、试管架、电炉、搪瓷杯、滴管、NaOH溶液、HCl溶液、琼脂、电子称,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基； 牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素； 蛋白胨主要提供氮源和维生素； NaCl提供无机盐； 在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂； 用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性。,牛肉膏蛋白胨培养基配方,牛肉

9、膏： 3.0g 蛋白胨： 10.0g NaCl ： 5.0g 蒸馏水 ： 1000mL pH ： 7.47.6 琼脂 ： 1520g（1.8%）,四、实验操作及步骤,1、称量 2、溶化 3、调pH 4、过滤（本次试验无需过滤） 5、定容 6、分装,7. 加塞 8. 包扎 9. 灭菌 10. 搁置斜面 11. 无菌检查,称量,蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。称完后，马上盖好盖子，瓶盖不要盖错。,溶化,称好后，加蒸馏水稍微加热，使其溶化。 在分装半固体及斜面时，琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，

10、需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。 若定量时需补水,调pH、过滤、定容,先pH试纸测试一下培养液的原始酸碱度 根据情况用稀酸或者稀碱调节至所需的pH值 不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 调节好后如果培养液比较浑浊，有杂质，先过滤定容。(本次实验无需过滤) 如果培养液澄清的，调节好pH值后定容至所需体积。,1配制10倍浓缩肉汤培养液（已配好）。 24人为一大组 每大组取50mL 10倍浓缩肉汤培养液 稀释成480mL，倒入搪瓷缸中 用NaOH或HCl溶液调整pH到7.2-7.6 用量筒定容至500mL。 3每大

11、组又分为A组和B组。,A组： 配半固体培养基：取30mL稀释后培养液加0.5%琼脂，加热溶解，分装至小试管中，每支3mL。补水 配液体培养基：取30mL稀释后培养液分装小试管，每支3mL。（不加琼脂） B组： 配斜面培养基：取30mL稀释后培养液加1.8%琼脂，加热溶解，分装中试管中，每支6mL。补水 配液体培养基：取30mL稀释后培养液分装小试管10支，每支3mL。（不加琼脂）,分装,4. 剩余380mL培养液置500mL锥形瓶中,加1.8%琼脂，配成固体培养基。（琼脂直接加到锥形瓶中） 5. 分别对试管和锥形瓶加塞,包扎. 6. 做好标记： 标记内容：培养基名称,班级及姓名,日期. 7.

12、湿热高压灭菌：121,20min. 8. 摆斜面. 9. 倒平板.,摆斜面,培养基灭菌,配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物 微生物生长繁殖： 消耗养分 改变培养的酸碱度 产生毒素或者抑制物,第二部分 消毒灭菌 （一）常用术语 1.灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法，包括杀灭细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。 2.消毒：杀死物体上或环境中病原微生物、并不一定能杀死细菌芽孢或非病原微生物的方法。 3.防腐：防止或抑制皮肤表面细菌生长繁殖的方法。 4.无菌：指不存在活菌，多是灭菌的结果。,灭菌是否彻底以杀死细菌的芽孢作为标准,消毒与灭菌方法,加热灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤除菌

13、 辐射灭菌 放射线辐照灭菌 紫外线灭菌 化学药品灭菌,巴氏消毒法,煮沸消毒法,间歇蒸汽灭菌法,高压蒸汽灭菌,干热灭菌,干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。 因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。,湿热灭菌 1. 高压蒸汽灭菌：最常用、灭菌效果最好。 （1）高压蒸汽灭菌的装置为高压灭菌锅； （2）原理：通过加热使水沸腾产生

14、蒸汽，待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出，灭菌器内的压力增加，从而使沸点增高，得到高于100的温度导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 （3）一般培养基用121，15-30min可达到彻底灭菌的目的。,高压锅,干烤箱,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三： 一、是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。 二、湿热的穿透力比干热大。 三、湿热的蒸气有潜热存在。1g水在100时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。,2.巴

15、氏消毒法： 通常将待消毒的液体、饮料等在60下加热30 min，既可杀死病原微生物又能保持原有的营养和风味。此法是巴斯德首先应用故称巴氏消毒法。 3.煮沸消毒法： 一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10-15 min，可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽胞。如延长煮沸时间，并在水中加入1碳酸氢钠或25石炭酸，效果更好。,4.间歇蒸汽灭菌法： （1）通过反复多次的流动蒸汽间歇加热以达到灭菌的目的。 （2）连续 3 d，每天100加热30 min；第一天加热后，其中的繁殖体被杀死，取出37孵育过夜，使残存的芽胞发育成繁殖体，第二天再100加热30min，如此连续三次，使彻底灭菌。,微孔滤膜过滤除菌,过

16、滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。 滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。有不同的孔径，实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22m。,紫外线辐射灭菌： （1）波长在 200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强，此波长的紫外线易被细胞中核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌。 （2）在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。 （3）紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。,化学药品灭菌： （1）是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法

17、。作用效果与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。 （2）杀菌剂：能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂，如重金属离子等； （3）抑菌剂：只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂，如磺胺类及大多数抗生素等。 （4）微生物实验室中常用的化学药品有：2煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25新洁尔灭、0.l升汞、3-5的甲醛溶液、75乙醇溶液等。,结果及讨论,观察所配置的培养基有无细菌及真菌生长，以判断灭菌是否彻底。,思考题,为什么一定要把培养基的pH控制在一定范围内？ 湿热灭菌和干热灭菌哪个效果好，为什么？ 干热灭菌和高压蒸汽灭菌设定温度和时间的依据是什么？,