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1、Chapter 7 蛋白质的分离、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 两性电解质 可解离基团：-NH3+ -COO- 侧链上的功能基团见（书P290） 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 PI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH. （见书P291表7-2）,二、蛋白质分子大小与形状 从60001000000Dalton(道尔顿） 为纪念原子学说（1803年）创始人John Dalton. Dalton=12C原子绝对质量1/12=1.6603310-27 （一）最低分子量测定 （二）滲透压（Osmotic pressure）测分子量 在理想的溶液中Osmotic pressure 与溶质浓度的关系为；
2、 = C=溶质浓度 R=气体常数（0.082) T=绝对温度 =渗透压,CRT,M,M=,RT,Lim,c,co,截距,C,/c,分子量1万10万范围内，结果可靠 （三）蛋白质的扩散 扩散系数（diffusion coeffecient) (四） 蛋白质的沉降分析超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋白质分子量 1. 沉降速度法（Sedimentation velocity） 沉降系数（Sedimentation coeffecient) 10-13=Svedberg 用 S 表示，生物分子在110-1320010-13秒范围。 Hoemglobin 沉降系数4.46S=4.46 1
3、0-13秒,M=,RTS,D（ 1- ）,（ 1- ）为浮力因子，其中为偏微比容=0.74cm3/g；=容剂密度（g/cm3) D=扩散系数 R=气体常数（8.314J/(k.mol) T=绝对温度（K） S=沉降系数,2.沉降平衡法 M=,2RTln(C2/C1),(1-) 2(x22-x21),(五）凝胶过滤法（gel filtration),分子筛效应：大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来,(五）凝胶过滤法 （gel filtration),分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来,(六）SDS-PAGE 蛋白质测分子量（sodium dodecyl sulfate polyacy
4、lamide gel electrophoresis),十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。,肌球蛋白,半乳糖苷酶,糖原磷酸化酶,牛血清白蛋白,卵清蛋白,碳酸酐酶,大豆胰蛋白酶抑制剂,溶菌酶,三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀,（一）蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统（disperse system), 蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质（dis
5、perse medium)。属胶体系统（colloidal system) 蛋白质,1. 质点大小在1-100nm范围内作Brown movement. 2. 质点带有相同电荷，相互排斥 3. 质点与溶剂形成水化层（hydration mantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。,分散相质点在胶体系统中保持稳定的条件,（二）蛋白质的沉淀 破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。 方法：1.盐析法(salt out) (NH2)4SO4, Na2SO4, NaCl 2. 有机溶剂 甲醇，乙醇， 丙酮 3。重金属盐 pH pI时 P带负电荷与 Hg2+, Pb2+, Cu2+, Ag+形成不溶
6、性盐 4. 生物碱 pHpI时，P+ 生物碱 沉淀 5. 加热变性沉淀法 少量盐加速蛋白质加热凝固。,四、蛋白质分离提纯的一般原则（separation and purification) 1. Pretrestment （匀浆， 研磨，超声波 ） 2. Rough fractionation （盐析，等电点， 有机溶剂） 3. Fine fractionation （层析）,五、蛋白质混合物的分离方法,（一）根据分子大小不同 1. 超过滤（ultrafiltration) 2. 密度梯度离心（density gradient centrifugal) 介质：蔗糖，Ficolls , 3. 凝
7、胶过滤层析（gel filtration chromatography) shephadex G-50, G-100,（二）利用溶解度差别分离蛋白质,1。等电点沉淀 2。蛋白质的盐溶和盐析 3。有机溶剂分级法 （三）根据电荷不同的分离方法 1。电泳（electrophoresis) 滤纸；薄膜 粉末平板（硅胶、纤维素粉） 细丝（尼龙丝、人造丝） 凝胶电泳（PAGE、Agarose),圆盘电泳（disc) 平板电泳 双向电泳 等电点聚焦（isoelectric focusing),2.离子交换层析,2.离子交换层析 介质：CMC CM-Sephadex G-50 DEAE-纤维素 DEAE-Sephadex A-25 A-50 QAE-Sephadex A-50,原理见动画片,(四）蛋白质的选择吸附分离 （adsorption chromatography) 介质：活性碳 硅胶 氧化铝 磷酸钙 硅藻土 （五）亲和层析法 抗原抗体 酶辅酶 酶抑制剂,六、蛋白质含量测定与纯度鉴定,Folin-酚法（Lowry法） 凯氏定氮法（标准方法） 紫外吸收法（280nm) Bradford法（考马斯亮蓝结合法）可测g蛋白质 纯度鉴定：PAGE， SDS-PAGE ， HPLC A280/A260=1.75,
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