《蛋白质一级结构》PPT课件

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1、第三章 蛋白质,第一节 概述,一、蛋白质的概念,二、蛋白质的研究简史,三、蛋白质的化学组成,四、蛋白质的分类,五、蛋白质的分布,六、蛋白质的生物学功能,蛋白质的概念:蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能，是表达生物遗传性状的一类主要物质。,1838年 Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后, 发现它们均可以用C40H62N10O12 来表示, 命名为“Protein”,并发展成 “基团” 学说 。 19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸, 基团学说销声匿迹。 190

2、2年Fischer, Hofmeister同时提出肽键理论。 1924年Svedberg 发明超离心机。,1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽。 1950年Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：-螺旋和-折叠。 1953年Sanger确定了牛胰岛素的一级结构。 1958年 Perutz 2. 运输蛋白; 3. 收缩运动蛋白; 4. 激素蛋白; 5. 细胞激动素; 6. 受体蛋白; 7. 毒素蛋白; 8. 营养贮藏蛋白; 9. 防御蛋白等。,蛋白质占干重 人体中（中年人） 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌

3、 14%50% 糖类1% 白地菌50% 无机盐7% 植物：主要在种子中含量较高。,蛋白质的分布,人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质g / 100g干组织）,我国一些谷物主要成分含量,蛋白质的生物学功能,1.生物体的组成成分 2. 催化 3. 运输 4. 运动 5. 抗体 6. 干扰素 7. 遗传信息的控制 8. 细胞膜的通透性 9. 高等动物的记忆、识别机构,酶蛋白,结构蛋白,免疫球蛋白,第二节 氨基酸,一、氨基酸的结构特点 二、20种基本氨基酸的分类 三、氨基酸的重要理化性质 四、氨基酸的分离制备和分析鉴定,氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。氨基酸是具有氨基（-NH3+）或亚氨基和羧基（-CO

4、OH）的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20种，其通式为：,氨基酸的结构特点： (1). 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸 (2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,注意： 氨基酸的构型是以距羧基最近的手性C原子为标准（除Gly外），而糖的构型是以距羧基最远的手性C原子为标准。,氨基酸的分类,中性AA （1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA （2）按R基团的 疏水性R基团AA 电性质分 不带

5、电荷极性R基团的AA 带电荷R基团的AA 脂肪族A （3）按R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA,人体必需氨基酸有八种： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “假 设 来 写 一 两 本 书”,(一)氨基酸的一般物理性质,常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异 溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。,(2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除

6、甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。,(5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,Tyr、Trp、Phe在近紫外光区的最大吸收峰（max）和摩尔消光系数,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103 ; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子

7、。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,（二）氨基酸的离解性质,如果在某一pH 值下，氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等，即净电荷为零，则称该 pH 值为该氨基酸的等电点 (pI)。,各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的pI在微酸性；碱性氨基酸的pI在碱性pH范围；酸性氨基酸的pI在酸性pH范围。 氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。,pH pI, 样品带负电荷，样品点向阳极移动 pH = pI, 样品不带电荷，样品点不移动,氨基酸等电点的确

8、定,（1）中性氨基酸,等电点（pI）的高低与氨基酸分子两性解离基团的解离平衡常数有一定关系。用K1、K2分别表示-COOH和-NH3+表观解离平衡常数时，它们的负对数分别用pK1、pK2表示，则中性氨基酸的等电点在数值上等于两个pK值之和的二分之一。即： pI = (pK1 + pK2) / 2,2.酸、碱性氨基酸,在溶液中氨基酸随pH升高而逐级解离时，总是pK值小的基团先解离，pK值大者后解离。因此，对于具有三个解离基团的氨基酸，只有靠近等电离子的两个pK值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写出解离反应式，皆可根据等电离子两边的pK计算其pI值。,酸性氨基酸： pI = (pK1 + pKR

9、-COO- )/2 硷性氨基酸： pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,（三）氨基酸的重要化学反应,1.与亚硝酸反应,反应特点： （1）脯氨酸不发生该反应； （2）只有 氨基氮可发生此反应，R上的氮几乎不参与反应。 （3）通过测定N2 的体积（摩尔数），可测定游离氨基氮。,2.与甲醛反应,反应特点： 反应放出H+ ，可用标准NaOH溶液滴定，是常用的测定氨基酸的反应。,3.脱羧反应,反应特点： 在专一性酶的催化下进行，放出CO2 ,工业上通过呼吸仪测定CO2的量来测定AA。,4.成盐反应,氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。,5.成肽反应,一个氨基酸的 氨基和另一个氨基酸 羧基脱水缩合，生

10、成的酰胺叫做肽，这种酰胺键叫做肽键。,肽键的平面特征,肽结构,6.茚三酮反应（鉴别反应）,在450nm处有最大吸收率，在0.550 g / ml范围内，氨基酸含量与光密度成正比。,7.羰氨反应： 氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素”。食品加工中将这种反应称为褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素则不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅影响原料利用率，而且有毒副作用。 8.个别R基团的反应（略）,从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或者分离分析氨基酸组成，需要分辩力很强的分离技术。层析法是近代生化中非常有效的常用分离方法。对

11、于氨基酸混合样品，或者其他各种性质相近，一般化学方法难以分离的混合样品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生素、抗生素、激素。等等，都能使用层析法达到分离分析的目的。,层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个是固定相，另一个是流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的方法。,层析技术的三个基本构成条件 水不溶性惰性支持物。 流动相（能携带溶质沿支持物流动）。 固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用）。,层析技术的分类,按流动相的状态分：液相层析（液

12、相色谱）、气相层析（气相色谱）。 按固定相的使用形式分类：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析。 按分离过程依据的理化性质分类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子筛过滤层析、亲和层析。,层析技术的应用 对于分子大小不等的化台物，例如含多种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的化食物，常用吸附层析法分离；对于既溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用分配层析分离；电解质混合物则宜用离交层析分离。,分配层析技术,分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。包括纸上层析、薄层层析、气相层析。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的

13、浓度比值。在层析条件确定后，分配系数是一个常数。以K表示。,分配层析的基本原理,分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。,另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可以沿固定相流动，即流动相。溶质在流动相的带动下流经固定相时，溶质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系数不同而分离。,纸上层析,纸上层析是以滤纸为支持物的一种分配层析。滤纸能吸收2225的水，其中67的水以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所以纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相的层析技术。由于各物质的

14、分配系数不同，移动的速率也就不同，从而达到分离的目的。,纸层析的Rf值,溶质在滤纸上移动的速率用Rf值表示：,Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比，在同一实验条件下，两相的体积比是一个常数。所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。,纸层析的操作,1.样品处理,2.点样,3.平衡,4.展开,5.显色,6.定性分析,7.定量分析,尽可能纯化，调节pH、浓度。,将样品溶液用微量注射器点在原点。,在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将滤纸饱和。,将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤纸移动。,为了看清斑点，用显色剂显色。,计

15、算Rf值，进行定性。,剪洗比色、直接比色、面积测量。,离子交换柱层析,离子交换柱层析是用离子交换剂作为水不溶性支持物兼固定相,装成层析柱，用不同pH和不同离子强度的缓冲液作流动相(洗脱液)构成的柱层析技术。这是目前应用非常普遍的分离技术，无论实验室还是生产领域都有广泛的实用性。,离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。即在不溶性母体上引入若干可解离基团。 不溶性母体：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。 引入的活性基团，可以是酸性基团，也可以是碱性基团。,在不溶性母体上引入酸性基团，如磺酸基（-SO3 H）、磷酸基（-PO3H2）、亚磷酸基（- PO2H）、羧基（-COOH

16、）等时，可解离出H+ ，与其它阳离子交换，这种离子交换树脂属于阳离子交换树脂。,在不溶性母体上引入碱性基团，如季胺-N+（CH3）3 、叔胺-N（CH3）2 、仲胺-NHCH3 、伯胺-NH2等含氨基的基团，可与OH-结合后，与其它阴离子交换，属于阴离子交换树脂。,分配系数（平衡常数）,在一定条件下，离子交换剂所吸附离子浓度和在溶液中的离子浓度达到平衡时，两者浓度之比叫做分配系数（也叫平衡常数）即：,K值的大小决定样品离子在柱内的保留时间。如果样品中各离子的K值差别足够大，这些离子通过离子交换层析就可以得到分离。 阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和力大的易吸附，难

17、洗脱；亲和力小的难吸附，易洗脱。,氨基酸的离子交换层析分离,当使用阳离子交换树脂柱时，在pH23的条件下，各种氨基酸都带正电荷，都能交换，上柱。与树脂的静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸（A2+）中性氨基酸(A+)酸性氨基酸(A)。,当用缓冲液洗脱时，随pH由低到高，氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基酸，R基团与树脂间亲和力小者先流出，大者后流出。,离子交换层析技术的自动化,返回,蛋白质的一级结构,蛋白质分子是蛋出质的具有完整生物功能的最小结构单位。,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次

18、: 一级结构：氨基酸序列 二级结构：-螺旋，-折叠 三级结构：所有原子空间位置 四级结构：蛋白质多聚体,一级结构又叫初级结构、基本化学结构或共价结构。1969年国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)定义为：一级结构即肽链中的氨基酸顺序。,一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。,研究一级结构需要阐明的内容包括： （1）蛋白质分子的多肽链数目。 （2）每条肽链的末端残基种类。 （3）每条肽链的氨基酸顺序。 （4）链内或链间二硫键的配置等。,多肽链,氨基酸通过肽键连接起来的链状物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽和

19、蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。 研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。,四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结构研究。,一级结构研究史上的两个第一,1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年获Nobel 化学奖。 1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。,多肽链的结构,一级结构中的二硫键,分析一级结构的一般程序,一级结构的分析是一项非常细致而又复杂的技术上作，基本工作程序是：,（1）将蛋白质纯化，测定末端组成。,（2）拆分蛋白质分于并将多肽分离纯化

20、。,（3）用酶法或化学方法进行专一性切割，得到系列长短不一的肽段。,（4）将肽段分离，通过末端分析方法测定各肽段的氨基酸顺序。,（5）根据二肽段的顺序重叠关系确定各个肽段的衔接顺序。排出完整多肽链的氨基酸顺序。,（6）确定二硫键的位置。,Sanger试剂(FDNB)标记N末端,ABCDE *ABCDE *A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE *A,*A+B, *A+B+C+D+E *A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E,一级结构与蛋白质功能的关系,一级结构中，有的部位保守性很强，既不能缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；有的部位

21、则可以改变，切除或更换别的残基都不影响生物活件；还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显活性。不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了蛋白质分子特定的空间构象的形成。,许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白亚基6 位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。,比较不同生物细胞色素C的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似,牛胰岛素分子的激活：,天然活性肽,除了蛋白质水解可以产生长短不等的肽段之外，生物体内还有很多游离存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属于激素类，如催

22、产素、加压素等都是九肽。,返回,蛋白质的空间结构,所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的构象而言。构象与构型都是立体化学结构概念，但含义不同。构型是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型。分子从一种构型变为另一种构型，例如从D-丙氨酸变为L-丙氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另生成）。,构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的种立体结构。这类立体结构不需要共价键断开，只要分产中发生CC单键的转动就能从一种构象变为另种构象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分

23、子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。定条件下，将蛋白质分子从细胞中分离出来，仍能保持其天然构象和生物活性。,维系蛋白质分子构象的化学键,蛋白质的二级结构,二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。为主链构象，不涉及侧链构象。包括-螺旋、 -折叠以及-转角，这些主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键平面、肽单元）为基本结构单位，有规则的盘曲而成的。也存在部分无规则卷曲。,肽键平面,肽键平面,肽链中的肽键平面,两个肽平面以一个C为中心发生旋转,蛋白质-螺旋结构,右手螺旋(顺时针)。 肽链的主链形成紧密的螺旋,侧链伸向外侧，每一圈包含3

24、.6个氨基酸残基,每个残基跨距为0.15nm,螺旋上升一圈的距离(螺距)为3.60.15=0.54nm，环内原子数13。 螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽键的NH和第四个肽键的CO形成氢键,第n个肽键的NH和第n+3个肽键的CO形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。,-螺旋结构形成的限制因素 凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不能形成氢键。 静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻,则因pH=7.0时都带负电荷,防碍螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍螺旋的形成。 位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,蛋白质折叠结构,-

25、折迭又叫-折迭片或-片层结构，也是蛋白质分子中常见的主链构象之一。所谓-折迭是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向聚集，按肽链的长轴方向平行并列，形成的折扇状构象。-折迭构象靠相邻肽链主链亚氨基（NH）和羰基氧原子之间形成有规律的氢键联结维系。,平行式,N端,N端,平行式与反平行式,蛋白质的-转角结构,又叫U型回折、-转弯或发夹结构。是近年来在球状蛋白质分子中发现的一种主链构象。球状蛋白质分子主链在盘曲折迭运行中往往发生180的急转弯，这种回折部位的构象即所谓-转角。-转角是由4个连续的残基组成的，第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构象。,二级结构的多元性,球

26、状蛋白质分子的二级结构一般都不是单一构象。主链的不同段落构象不同，多种构象单元交替连接组成整条肽链的二级构象。,蛋白质的三级结构,蛋白质分子在一、二级结构基础上，再进行三维空间的多向性盘曲折迭。形成特定的近似球状的构象，称为步白质分子的三级结构。根据l 969年IUPAC的定义，三级结构包括蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系。,蛋白质三级结构的构象特点,（1）三级结构构象近似球形。 （2）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓“亲水表面，疏水核”。 （3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层，

27、对蛋出质分子构象起很好的保护作用。 （4）三级结构形成之后，蛋白质分子的生物活性部位就形成了。,结构域,有些较大的球状蛋白质分子或亚基，常常先由几个二级结构单元组合在一起形成超二级结构，以此作为形成三级结构的实体，这些超二级结构实体称为结构域，又叫辖区。结构域进一步缔合则形成近似球形的三级结构。,蛋白质的四级结构,有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的三级结构单位缔合而织成的，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位）。所谓蛋白质分子的四级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基与亚基间的立体排布及相互作用关系，亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容，但不涉及亚基本身的构

28、象。,两个亚基的结构,血红蛋白,寡聚蛋白质分子的亚基组成,据统计，已经研究过的寡聚蛋白质分子达700多种。它们的亚基数目差别很大，少则几个，多则十几个，数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的。其中，两个或四个亚基者最多。奇数亚基的分子很少见。,亚基类别组成有两种类型。一种是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，如过氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四聚体，每个亚基的一、二、三级结构都相同，功能也相同。另一种是由结构不同的亚基组成的非均寡聚蛋白，如血红蛋白（22）。,维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。 含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结

29、构才有生物学功能。,蛋白质的一、二、三、四级结构,蛋白质分子构象与功能的关系,蛋白质分子的构象并不是固定不变的。许多蛋白质在表现其生物学功能时，构象发生变化，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为变构现象。血红蛋白在表现其输氧功能时的变构现象就是一个典型的例子。,1.血红蛋白的结构与功能的关系 血红蛋白是由两个-亚基和两个-亚基组合而成的四聚体。血红蛋白的亚基中分子各有一个血红素，能结合一分子O2 。血红蛋白的亚基之间相互作用形成了稳定的四级结构，使其中的血红素与O2的亲和力变得很弱。,当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与O2结合，立即引起该亚基的构象发生改变，这种构象变化随即通过亚基间的次级键

30、引起另外3个亚基的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，使所有尚未与O2结合的亚基都变成适宜于与O2结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。,2.核糖核酸酶S的空间结构与功能的关系,核糖核酸酶S三维结构的形成与维系也有赖于多肽链内部的4个二硫键，60年代初，有人在含有巯基乙醇的8molL尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶S变性失活，然后透析除去尿素和巯基乙醇。,在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，变性的核糖核酸酶S结构由伸展的肽链自动折叠，重新形成的二硫键配对完全正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。,这个实验充分证明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨

31、基酸序列之中。,返回,蛋白质的重要理化性质,因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋白质上。如两性解离和等电点、成酯反应、成盐反应、一些显色反应、光吸收性质等在蛋白质上都有所表现。不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质大分子已经发生了质的变化，所以，蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多性质。,1.蛋白质的胶体性质,蛋白质是生物大分子，相对分子质量一般都在1100万之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带

32、的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。,蛋白质胶体性质的应用,透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。,膜分离与超滤技术：透析是一种膜过滤技术，曾为生物大分子的分离纯化起过重要作用。70年代以来随着合成滤膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤技术，它是利用具有选择透过性的微孔滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内侧，从而达到分离

33、纯化的目的。,2.蛋白质的两性解离和等电点,蛋白质等电点的应用,等电沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电沉淀技术。,电泳技术：在溶液pH值不等于等电点的条件下，蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性质不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳分离的技术，称力蛋白电泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验手段。,3.蛋白质的变性作用,在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的次级键断裂，

34、二、三级空间结构被破坏，分子的紧密构象变成了松散的无序状态。天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。叫做蛋白质的变性作用。,注意：蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。,造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。,变性,复性,注意：并不是所有变性蛋白都可以复性的！,变性蛋白质的性质,理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应增强。 生化性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解。 生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一。,

35、4.蛋白质的沉淀作用,蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀现象。这即所谓蛋白质沉淀作用。,蛋白质的沉淀性质的应用,盐溶与盐析：,在蛋白质溶液中加入中性盐（如NaCl、（NH4）2SO4等）时，可产生以下两种现象：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称盐溶。盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，促进蛋白质的溶解。,与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为盐析。

36、,盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结合大量自由水，降低水分活度；一方面又夺取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质分子之间互相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。,利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方法叫做盐析沉淀法。,不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一般而言，相对分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同一溶液中不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来，这种方法称为分级盐析。,等电点盐析沉淀：盐析与等电点结合沉

37、淀效果更好。一般是先将蛋白质溶液的pH调至目的蛋白质的等电点。然后再加固体(NH4)2SO4或其饱和溶液，使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀析出。,有机溶剂沉淀： 水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，具有介电常数比较小，与水的亲和力大，能以任何比例与水相溶等特点。当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时，还能降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。,与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的浓度也与蛋白质相对分子质量有关，相对分子质量大的要求浓度低，相对分子质量小的要求浓度高。不同相对分子质量的混合溶液，可以通过调节有机溶剂的浓度达到分级沉

38、淀的目的。,等电点有机溶剂沉淀： 有机密剂沉淀法若与等电点结合，沉淀更易发生，而且彻底。先将提取液pH调至目的蛋白质的等电点、再加有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会很快沉淀析出。,注意：在对蛋白质的影响方面，与盐析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，因此，用这种方法进行操作时需要注意：（1）低温操作。 （2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好。,失活沉淀：,重金属盐沉淀：当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。误服重金属盐的病人，大量口服牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，

39、就是因为这些食物中的蛋白质与重金属离子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体外。达到解毒的目的。,生物碱试剂沉淀：当溶液的pH低于等电点时，蛋白质分产是阳离子形式存在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发生蛋白质分子变性。实验室中常用这些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以澄清，防止成品啤酒混浊。,热凝固沉淀：蛋白质受热变性后，将pH调至等电点，则很容易发生凝固沉淀。其原因是：由于变性蛋白质的空间结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，同时由于等电点破坏了带电状态等而发生絮结沉淀。我国传统的

40、做豆腐工艺是将豆浆煮沸，点入少量盐卤（含MgCl2）或石膏（含CaSO4），或者点入酸浆或葡萄糖酸内酯将pH调至等电点，热变性的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤成型则成豆腐。,5.蛋白质的颜色反应,（1）双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨气。,双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，该反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩腺反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应定性蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。,（2）Millon（米伦）： 反应

41、米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试剂后立即产生白色沉淀，再加热后，沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。,（3）黄色反应 ：这是含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。,（4）乙醛酸反应 ：在含有蛋白质的溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢注人浓硫酸，在两液层之间会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含有色

42、氨酸的蛋白质有此反应，但不含色氨酸的白明胶就无此反应。,（5）茚三酮反应 ：蛋白质和氨基酸一样，也能与水合前三酮反应，生成蓝紫色化合物。实践中常利用这一反应来检测蛋白质的存在。但不能区别蛋白质与氨基酸。,（6）Folin（福林）-酚试剂反应 ：蛋白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能将福林-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质的含量。,（7）坂口反应 ： 蛋白质分子中的精氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次溴酸钠及a-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应用以测定精氨酸或含有精氨酸的蛋白质。,6.蛋白质的紫外吸收,一般蛋白质在280nm

43、波长处都都最大的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。通常利用这些特异性的吸收，可以测定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质存在的话，可用来测定浓度为0.1一0.5mgml的蛋白质溶液。,返回,蛋白质相对分子量的测定,小分子化合物相对分子质量的测定方法,冰点降低法、沸点升高法或蒸汽压减小法,蛋白质是大分子胶体物质，这些方法不适用。,常用方法有：,化学分析方法,超离心沉降速度法,凝胶过滤层析法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,超离心沉降速度法,对蛋白质溶液进行56万r/min的高速离心，蛋白质分子会向离心池底部方向移动，离心池上面为清液，清液与下面的溶液之间出现一个界面。用光学方

44、法测定界面移动的速度，即为蛋白质的离心沉降速度。根据下面的公式可求出溶质的沉降系数。,x界面移动距离 t离心时间 角速度 S沉降系数,由沉降系数S可根据斯维得贝格（Sved berg）方程计算相对分子质量。,沉降系数S的意义与应用,沉降系数S是文献中经常使用的物理量。其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。一个S单位是l10-13s，相对分子质量越大，S越大。蛋白质的沉降系数大都在1200S之间。 当一种新发现的大分子，其结构、性质和功能都处在研究过程中时，其名称未定，为了描述方便，常用其沉降系数S来表示。,凝胶过滤法,葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子质量常用的方法之一，葡

45、聚糖凝胶颗粒有三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱体积大。,若用多种已知相对分子质量的标准蛋白质准确测得各自的洗脱体积（Ve），以Ve对相对分子质量对数作图，得标准曲线，再用同样条件测定未知样品洗脱体积（Ve），从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶过滤法可测定（180）万范围内的相对分子质量，误差为5。但对变性蛋白和线性分子不适用。,化学分析方法,此法是测定特征性化学成分，计算最低相对分子质量。首先利用化

46、学分析方法则定蛋白质中某一持殊成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白质分子中该元素共有一个原子（或一分子某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分子质量。,例如，测得细胞色素c的铁元素含量为0.43，已知铁相对原子质量为55.8，则最小相对分子质量（M）为： M55.3100/0.4313000 因为细胞色素c分子只有一个铁卟啉辅基，所以，计算结果与其他方法测得的真实相对分子质最相当。,如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。例如，血红蛋白分了中含铁0.335，计算出其最低相对分子质量为1.67万。只相当于其他方法所得血红蛋白相

47、对分子质量的1/4。可见，血红蛋白分子中实际含有4个铁原子，其真实相对分子质量为最小相对分子质量的四倍。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸钠（SDS）溶液中于100热处理，并加巯基化合物将二硫键打开。则蛋白质变性，伸展成棒状并与SDS结合而带上大量的负电荷，这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就相对地不重要了。所结合的大量SDS负电荷决定着分子的带电性质。蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少。因此，不管分子大小，荷质比是相同的。,在上述情况下，荷质比对不同分子量的SDS-蛋白质的电泳迁移率的影响不会有什么差别了。凝胶的分子

48、筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力，这是影响迁移率的主要因素。同一电泳条件下，分子小，受阻小，泳动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小。,进行SDS-蛋白电泳时，用一种染料（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距离和原点到前沿距离的比值：,R与相对分子质量的对数成一定比例关系，测定几种已知标准相对分子质量的R，并对相对分子质量对数作图，得一直线。根据未知相对分 子质量的R可从图上查得相对分子质量。这种 方法速度快，样品用量 少，缺点是误差大，误 差来源于迁移距离的测量。,重点复习： 1.氨基酸种类、结构特征、性质； 2.蛋白质结构、结构与功能的关系； 3.等电点理论及其应用； 4.蛋白质变性理论及其应用； 5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基本原理。 6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。,Hi 下课了！,