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1、（6）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录录翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。密码、终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、选择标记、选择标记、多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）
2、转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的表达载体的结构结构大肠杆菌乳糖操纵子的调控大肠杆菌乳糖操纵子的调控操纵子与操纵子模型操纵子与操纵子模型 操纵子学说操纵子学说/操纵子模型：操纵子模型：F.Jacob J.Mond（1960）E.coli lac operon(1965诺贝尔医学诺贝尔医学生理学奖生理学奖)操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由结构基因、操作子（单元，由结构基因、操作子（O）和启动子（）和启动子（P）组成。组成。转录、翻译、合成蛋白转录、翻译、合成蛋白 结合调节蛋白结合调节蛋白 结合结合RN
3、A聚合聚合酶酶 promoter structural genes operator启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因操纵子操纵子(operon(operon)模型模型调控（节）蛋白调控（节）蛋白 操纵子操纵子RNARPO structural genesDNAProtein调控蛋白的作用机制注：注：R R：Regulator PRegulator P：Promoter OPromoter O：OperatorOperator 正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducerapoinducer)负调控系统中
4、的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（repressor)repressor)(四四)经典的大肠杆菌质粒载体经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质的大肠杆菌质粒载体。粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal
5、 I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（4 4）克隆位点）克隆位点2.ColE1（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb。（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1对对E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞个细胞1000-30001000-3000拷贝拷贝之多！之多！colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶
6、菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea+kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫型免疫型（ImmE1+）。）。EcoR I（4 4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin3.pBR322：F.Bolivar和和R.L.Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。“P”表示是一种质粒
7、表示是一种质粒(plasmid)；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一表示两位主要构建者姓氏的头一个个 字母字母“F.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。表示实验编号。pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因（1）元件来源）元件来源 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4361bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致
8、Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活
9、但在但在Amp中死亡中死亡每个细胞可达每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mobmob）的作用位点。）的作用位点。（6 6）pBR322pBR322的缺点的缺点能够被能够被ColKColK质粒编码的质粒编码的mobmob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就
10、有可能转移！删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322pBR322上切去上切去HaeIIHaeII片断，既除去片断，既除去了了mobmob识别位点，又增加质粒的拷贝识别位点，又增加质粒的拷贝数。数。（7）PBR322的改进pBR325：在在pBR322pBR322位点上接入一段来自噬菌体位点上接入一段来自噬菌体PICmPICm的的HaeIIHaeII酶切片断（带酶切片断（带有氯霉素抗性基因有氯霉素抗性基因cmlcmlr r）。）。cmlcmlr r上也带一个上也带一个EcoRIEcoRI位点。位点。使使EcoRI 也
11、成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。改造改造EcoR I 位点位点4.pUC系列University of California的的J.Messing和和J.Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改造的基础上改造而成。属正选择载体。而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的-肽链序列，肽链序列，是是LacZ 的氨基端片断。的氨基端片断。pBR322的的Ampr基因基因（2）长度）长度约约2.7kb（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。叫叫5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-B-D-半乳糖苷半乳糖苷
5第五第二章基因工程载体和工具酶98
