基因工程3-3基因操作的工具酶

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1、3.3 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。反应特点：(1)以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物(2)反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定(3)聚合反应需要有引物存在，且引物要有3-OH游离基团(4)DNA链的生长方向为5 3(5)产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。种类：到目前为止，已从E.coli 中发现了Pol I、Pol II、Pol III三种DNA聚合酶。其中Pol I 和Po

2、l II的主要功能是参与DNA的修复过程，Pol III与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆关系密切。3.3.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I（E.coli DNA Pol I）DNA Pol I是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65 DNA Pol I已得到高度纯化，从100 kg大肠杆菌中可以分离到约500 mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的Pol I。1.DNA Pol I在空间结构上有三个位点：在空间结构上有三个位点：(1)DNA模板结合位点结合模板 (2)核苷酸-磷酸结合位

3、点结合引物 (3)dNTP结合位点结合底物2.DNA Pol I是一种多功能酶：是一种多功能酶：(1)5 3的聚合酶活性 催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3-OH末端，沿着引物的3-OH方向按模板顺序从5 3延伸。每分子DNA pol I每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。(2)5 3的外切酶活性 只作用于双链DNA（dsDNA），从5端切割下一个个单核苷酸。(3)3 5的外切酶活性 能从游离的3末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3 5外切酶活性受到5 3聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由

4、3 5外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3 5核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。3.E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途在基因工程中的用途:(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组 (2)用于DNA序列分析 (3)用于制备DNA探针 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5一侧的核苷酸不断地被移去，3一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DN

5、A分子按合 成 的 方 向 移 动 缺 口 平 移（N i c k Translation）。应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、32PdNTP和未标记的dNTP。脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5-磷酸末端的单（寡）核苷酸。由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2 mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20 mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记

6、的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP。改变反应体系中DNase I的数量，可以控制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链。3.3.2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I的的Klenow片段片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment）用蛋白酶将DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量为75000 dal和36000 dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5延伸

7、末端）。对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5延伸末端可用32PdATP标记：而BamH I切割后形成的5延伸末端可用32PdGTP标记：3.3.3 T4 DNA聚合酶聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶。1.T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：聚合酶也是一种多功能酶：(1)5 3的聚合酶活性(2)3 5的外切酶活性 其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍。(3)取代反应活性 如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3 5外切酶活性将从dsDNA的3末端降解，直到互补于这个dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反

8、应。2.T4 DNA聚合酶在基因工程中的应用聚合酶在基因工程中的应用(1)以填充反应标记带有5延伸末端的dsDNA片段(2)将DNA的3延伸末端切成平末端(3)以取代反应标记带有3延伸末端或平末端的dsDNA片段(4)以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针（链特异的探针）3.3.4 逆转录酶逆转录酶 是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA称cDNA，即互补DNA。1.1.逆转录酶也是一个多功能酶：逆转录酶也是一个多功能酶：(1)RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。几乎所有

9、真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。(2)DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。(3)外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：*从RNA链 5末端外切：称5 3外切RNA酶 *从RNA链 3末端外切：称3 5外切RNA酶2.逆转录酶在基因工程中的应用：逆转录酶在基因工程中的应用：主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA，从而制备基因片段。3.商品化的

10、逆转录酶有两种：商品化的逆转录酶有两种：(1)禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶(2)Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶 AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA，但它有很强的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱，更有利于制备全长的cDNA。两种逆转录酶均无3 5外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。3.4 DNA和和RNA的修饰酶的修饰酶3.4.1 核酸酶核酸酶SI1.作用特点：作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又称单链特

11、异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或小裂缝（gap）处降解dsDNA。2.作用条件：作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5，这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。(1)切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。(2)切除cDNA的发夹结构。3.4.2 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶1.作用特点：作用特点：此酶是从小牛胸腺中提取的，可催

12、化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在时才能作引物。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）。3.4.3 外核酸酶外核酸酶III1.作用特点：作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)产生具有5延伸末端的DNA片段(2)制备特异的DNA探针3.4.4 外核酸酶外核酸酶Bal 311.作用特点：作用特点：此酶是

13、从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA，对3、5两端的降解速度相同。2.作用条件：作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活。3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。3.4.5 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.作用特点：作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的。能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上。2.在基

14、因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化。3.4.6 碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）1.作用特点：作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP，从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)在用32P标记DNA的5末端之前

15、，除去磷酸。(2)在DNA重组技术中，除去DNA片段的5-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上。9、静夜四无邻，荒居旧业贫。22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、雨中黄叶树，灯下白头人。21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、以我独沈久，愧君相见频。22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、故人

16、江海别，几度隔山川。21:27:4821:27:4821:27Saturday,October 08,202213、乍见翻疑梦，相悲各问年。22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,202214、他乡生白发，旧国见青山。2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、比不了得就不比，得不到的就不要。2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、行动出成果，工作出财富。2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、做前，能够环视四周；做

17、时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.89、没有失败，只有暂时停止成功！。22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。21:27:4821:27:4821:27Saturday,Octo

18、ber 08,202213、不知香积寺，数里入云峰。22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,202214、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、楚塞三湘接，荆门九派通。2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、空山新雨后，天气晚来秋。下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.

19、89、杨柳散和风，青山澹吾虑。22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。21:27:4821:27:4821:27Saturday,October 08,202213、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,20

20、2214、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.8MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感 谢 您 的 下 载 观 看感 谢 您 的 下 载 观 看专家告诉