实验四总氮量的测定——凯氏定氮法

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1、实验四 总氮量的测定凯氏定氮法目的和要求目的和要求v1.学习凯氏定氮法的原理。学习凯氏定氮法的原理。v2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。馏、滴定及其含氮量的计算等。实验原理实验原理v天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。的含氮量用凯氏定氮法来测定。v当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化氮、二氧化碳及水。氮转变

2、出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。v消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，然后用标准碱

3、溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。从而折算出含氮量。v以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：v测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子氢离子结全，生成铵离子，使溶液中氢离子浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶浓离降低。然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当液中原来氢离子浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。量数即相当于被测样品中氨的当量数。v本法适用的范围为本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应氮。相对误差应小于小于

4、2%。试剂试剂v浓硫酸浓硫酸 v硫酸铜硫酸铜 v硫酸钾硫酸钾 v氢氧化钠溶液：氢氧化钠溶液：400g/Lv硼酸吸收液：硼酸吸收液：40g/L，称取，称取20g硼酸溶解于硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。热水中，摇匀备用。v HCl标准溶液：标准溶液：0.1000mol/L。v甲基红甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：溴甲酚绿混合指示剂：5份份2g/L溴甲酚绿溴甲酚绿95%乙醇溶液与乙醇溶液与1份份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。甲基红乙醇溶液混合均匀。主要仪器：主要仪器：如图，凯氏定氮蒸馏装置。如图，凯氏定氮蒸馏装置。50mL消化管消化管50mL容量瓶容量瓶分析天平分析天平电炉电炉小玻璃珠小玻璃珠

5、3mL微量滴定管微量滴定管烘箱烘箱1000mL蒸馏烧瓶蒸馏烧瓶远红外消煮炉远红外消煮炉实验流程实验流程u样品消化样品消化u蒸馏吸收蒸馏吸收u滴定滴定实验流程实验流程u样品消化样品消化v准确称取准确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。左右的干燥面粉作为本实验的样品。v准备准备4个个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加号烧瓶内各加入样品入样品0.1g，催化剂（，催化剂（K2SO4-CuSO45H2O）200mg，消，消化液化液5mL。注意加样品时应直接送入烧瓶底部，切勿沾于瓶。注意加样品时应直接送入烧瓶底部，切勿沾于瓶口及瓶颈上。向口及瓶颈上。向3、4

6、号烧瓶加入号烧瓶加入0.1ml蒸馏水和与蒸馏水和与1及及2号瓶号瓶相同的催化剂和浓硫酸，作为空白对照，测量试剂中可能含相同的催化剂和浓硫酸，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。有的微量含氮物质，以对样品进行校正。v小心摇匀后，按图安装消化装置，置于电炉上，在通风橱内小心摇匀后，按图安装消化装置，置于电炉上，在通风橱内加热消化。加热消化。v消化时先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，消化时先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，再继续加热微沸再继

7、续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入，取下冷却，小心加入20mL水，移入水，移入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。u蒸馏、吸收蒸馏、吸收v取取23个个50ml的维形瓶，加入的维形瓶，加入5ml左右左右2%硼酸硼酸-指示剂混指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。准确吸取合液，用表面皿覆盖备用。准确吸取10mL样品处理液由小样品处理液由小漏斗流入反应室，并以漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。从安

8、全漏斗中慢慢加入内，塞紧玻璃塞。从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。v待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。u滴定滴定v全部蒸馏完毕后，用全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定各标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示

9、剂混合液由绿指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。色变回淡紫色，即为滴定终点。结果计算结果计算%10010000140100.0%/CBA）（克氮样品的总氮含量若测定的样品含氮部分是蛋白质，则有若测定的样品含氮部分是蛋白质，则有%1001000040100.0%/CBA克氮样品的总氮含量式中：式中：A为滴定样品用去盐酸平均毫升数：为滴定样品用去盐酸平均毫升数：B为滴定空白用去为滴定空白用去盐酸平均毫升数；盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数；为称量样品的克数；0.0100为盐酸的当量为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓

10、度填写）；14为氮的原子量；为氮的原子量；6.25为系数（为系数（1ml0.01N盐酸相当于盐酸相当于0.14mg氮）。氮）。v若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加氯乙酸，使其最终浓度为最终浓度为5%，然后测验定未加三氯乙酸的样品及加入三，然后测验定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氯乙酸后样品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。氮量，从而

11、计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。蛋白氮蛋白氮=总氮总氮-非蛋白氮非蛋白氮蛋白质含量（克蛋白质含量（克/%）=蛋白氮蛋白氮6.25注意：v蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影蒸馏时实验室中切忌有碱性雾气（如氨），否则将严重地影响实验结果的准确度。响实验结果的准确度。v若反应室内液体太多，超过若反应室内液体太多，超过1/2，又不易排出时，只能拆开，又不易排出时，只能拆开仪器倒出贮液。但是一般尽量避免发生此种情况。折卸时应仪器倒出贮液。但是一般尽量避免发生此种情况。折卸时应特别小心，防止损坏仪器。拆卸仪器应首先放松用来固定冷特别小心，防止损坏仪器。拆卸仪器应首先放松用来固定冷

12、凝管的万能夹，然后小心地将冷凝管向下错开，待反应室外凝管的万能夹，然后小心地将冷凝管向下错开，待反应室外壳与冷凝管分开后，再移动反应室。壳与冷凝管分开后，再移动反应室。v“空白空白”滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氨。滴定值包括水及氢氧化钠溶液中含有的微量的氨。因些，水质对因些，水质对“空白空白”滴定值的影响甚大。滴定值的影响甚大。“消化样品消化样品”最最后用后用“消化空白消化空白”进行校正计算，进行校正计算，“不消化的样品不消化的样品”最后用最后用“不消化的空白不消化的空白”进行校正计算。而且，在实验中，稀释样进行校正计算。而且，在实验中，稀释样品的水与品的水与“空白空白”的水应当取

13、自于同一瓶中。的水应当取自于同一瓶中。v蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白质都有恒蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白质都有恒定的含氮量，一般大约为定的含氮量，一般大约为14-18%，平均为，平均为16%。由凯氏定。由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数氮法测出含氮量，再乘以系数6.25（即每含氮（即每含氮1g，就表示该，就表示该物质含蛋白质物质含蛋白质6.25g）即为蛋白质量。）即为蛋白质量。v最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮最好将三氯乙酸沉淀的蛋白质部分再去消化，消化后测含氮量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。量，这个含氮量应相等于由总氮及非蛋白氮计算的蛋白氮量。但操作麻烦一些。但操作麻烦一些。