三章酶的分离纯化

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1、第三章 酶的分离纯化l各种分离方法的操作原理l分离方法的应用原则l酶分离纯化中应注意的问题酶天然酶人工改造酶动物植物微生物粗酶精制酶 冻干酶粉 溶液态酶化学的生物的固定化酶 化学修饰酶抗体酶基因工程酶3.1 酶纯化的必要性酶纯化的必要性3.2 起始材料的选择起始材料的选择3.3 酶的萃取酶的萃取3.4 分离方法分离方法3.5 酶纯化步骤的设计酶纯化步骤的设计3.6 纯化步骤的定量评价纯化步骤的定量评价3.7 在纯化过程中酶活力的损失在纯化过程中酶活力的损失3.1 3.1 酶纯化的必要性酶纯化的必要性l生物细胞中同时存在多种多样的酶。生物细胞中同时存在多种多样的酶。l酶在生物细胞中的分布并不是均

2、一的。酶在生物细胞中的分布并不是均一的。l许多酶可能作用于同一个底物。许多酶可能作用于同一个底物。3.2 3.2 起始材料的选择起始材料的选择l不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。l微生物培养物微生物培养物l注意材料的年龄注意材料的年龄l注意在生物体内的富集区域注意在生物体内的富集区域3.3 3.3 酶的萃取酶的萃取（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。）（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。）（1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞

3、外酶的测定）（2）酶的萃取：萃取液）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料倍于起始材料 缓冲液缓冲液(pH 7.5)的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度的作用，中和从空泡中放出的大量酸；高离子强度(0.1-0.5)有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪有助于将酶从结合的膜上解析下来；丙酮粉有助于将酶与脂肪或磷脂膜分离。或磷脂膜分离。注意事项注意事项：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂）：蛋白酶的抑制方法（低温快速、抑制剂）制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。制备丙酮粉用以解除酶与脂肪或磷脂膜的结合。除去核酸：调整除去核酸：调整pH沉淀（鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解沉淀（

4、鱼精蛋白硫酸盐或链霉素）、水解3.4 3.4 酶的分离方法酶的分离方法（1）以大小或质量为依据：）以大小或质量为依据：离心（离心（300000g)、凝胶、凝胶过滤（过滤（Sephadex交联葡聚糖、交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤胺）、透析、超过滤（2）以电荷为依据：）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、离子交换色谱（低离子强度、适当适当pH）Sephadex、DEAE-纤维素、纤维素、CM-纤维素；纤维素；电泳（电电泳（电荷、分子大小、分子形状）荷、分子大小、分子形状）纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺酰胺；等电聚焦（；等电聚

5、焦（pH梯度中的平衡位置）梯度中的平衡位置）（3）以溶解度变化为依据）以溶解度变化为依据：改变：改变pH、改变离子强度、改变离子强度、降低介电常数降低介电常数（4）以特异性结合位置为依据）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗亲和色谱、亲和洗提提（5）其它方法）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩离心凝胶过滤透析和超过滤l原理原理：以质量不同为分离依据：以质量不同为分离依据l离心力离心力5000

6、-50000g5000-50000gl处理量可达几升处理量可达几升l分离对象分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶细胞碎片、沉淀下来的酶高速高速离心 速度一般在20,000以下。超离心超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在80,000250,000 g 之间。主要分离小分子量酶。沉降速度,离心法（区带离心法），等密度梯度离心法（沉降平衡法）。）。l原理原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不能进入微孔的大分子未被阻滞。能进入微孔的大分子未被阻滞。l换句话说，分离是因为不同分

7、子在进入或不进换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。l其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析层析lSephadexSephadex(交联葡聚糖）、交联葡聚糖）、Bio-Gel(Bio-Gel(交联聚丙交联聚丙烯酰胺）烯酰胺）l酶后期处理（小量试样）酶后期处理（小量试样）葡聚糖凝胶操作流程：葡聚糖凝胶操作流程：1）选择选择 根据分子量大小范围选择凝胶。根据分子量大小范围选择凝胶。凝胶凝胶 如如:G50排阻排阻1,500-30,000（Sephadex）还有粗，中，细分，

8、细的分辩率高还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的流速慢；粗的分辩率低分辩率低,流速快。流速快。2）溶涨溶涨 水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。3）装柱装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡不能有气泡，用缓冲液平衡4）上样上样 按柱床体积计算约按柱床体积计算约1/40左右。左右。然后用缓冲液洗脱。注意流速。然后用缓冲液洗脱。注意流速。5）再生再生 稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微 生物生长，加生物生长，加0.02%NaN3 使用时要注意可能抑制你要分离的酶。使用时要注意可能抑制你要分离的酶。聚丙

9、烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶基本相同基本相同琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱水 Sepharose 半乳糖相间排列而成。如：如：4B即琼脂糖含量占4%。另外的商品商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种 化学稳定性和机械强度更好，应用更大。作用：浓缩，脱盐等，分级分离 l透析膜透析膜：带有微孔的筛子：带有微孔的筛子l小于等于小于等于2000020000的大分子通过，更大的分子不的大分子通

10、过，更大的分子不通过。通过。l除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂l超过滤超过滤：在：在0.29 0.29 MPaMPa氮气压力下使酶液透过透氮气压力下使酶液透过透析膜。析膜。l浓缩酶液浓缩酶液l离子交换色谱离子交换色谱l电泳电泳l等电聚焦等电聚焦l取决于带相反电荷基团的静电吸引。lDEAE-纤维素（二乙基氮基乙基-纤维素）结合带负电荷基团，阴离子交换剂lCM-纤维素（羧甲基-纤维素）结合带正电荷基团，阳离子交换剂离子交换纤维素离子交换纤维素:是纤维素作为母体，引入相应的交换 基团，蛋白质不容易变性，交换容量大 （0.2-1.0mg/克干胶）离子交换

11、树脂离子交换树脂:聚苯乙烯树脂聚苯乙烯树脂引入相应的解离基团，分阴，阳离子交换树脂。有强酸，强碱，弱酸，弱碱。离子交换凝胶离子交换凝胶:葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入 相应的交换基团，交换容量更大2.5-4.5mg/克干胶）1 1）离子交换剂选择：）离子交换剂选择：酶蛋白在pI的pH条件下稳定 用阳离子交换剂。酶蛋白在pI的pH条件下稳定 用阴离子交换剂 在pI pH,pI pH条件下稳定 二种交换剂都可用 2 2）如何选择强型和弱型交换剂）如何选择强型和弱型交换剂 酶蛋白pI在 9 时 考虑用强型离子交换剂 酶蛋白在强型或弱型离子 考虑到酶的不稳定性，交换剂通用，选弱型。l解吸方法：改变

12、pH（改变结合基团的电荷），提高溶液的离子强度（与酶竞争结合位置）l使用规模可大可小l纯化倍数为10左右l原理：在外加电场的影响下，带电分子具有不同的运动速度。l支持介质：纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺l小规模或分析水平，也可在制备水平依据依据：在pH梯度中的平衡位置。用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度，而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。分辩率高，pI相差0.01 pH的酶与蛋白质可分离。注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和质量。聚焦层析：聚焦层析：兼有等电聚焦灵敏度高和柱层析简便的双重特点。原理：原理：用特定的多缓

13、冲液滴定和淋洗层析柱特定的多缓冲交换剂，随着缓冲液的扩展，会自上而下建立pH梯度，而蛋白质也在相应pH梯度处聚焦，随着缓冲液的下移而下移，最后从层析柱中流出来。关键关键：选好多缓冲交换剂多缓冲交换剂和多缓冲液。多缓冲液。如：PBE94 阴离子交换剂和 Polypuffer96多缓冲液。流程:1）选好多缓冲液和多缓冲交换剂 2）调整起始缓冲液pH上限,用平衡的多缓冲交换剂装柱，3）调整起始缓冲液pH梯度下限,用下限缓冲液510毫升过柱 4）上样品，用这个下限缓冲液洗脱，并分部收集。5）多缓冲交换剂再生和平衡。操作 1.PBE118 应用pH范围：pH9以上 PBE94 应用pH范围：pH 96

14、或 pH 74 2.选pH梯度 已知酶的等电点，选择酶在1/31/2处洗出，分辩率高，而且省材料和时间。3.上样量 2030ml柱床体积,可分离200mg蛋白质/pH 4.洗脱液量 一般为10倍柱床体积 5.流速 3040ml/小时 6.再生和储藏 用1mmol/L NaCl洗涤，0.1NHCl洗，用高pH缓冲 液平衡，放适宜pH的起始缓冲液保存。可以加 24%乙醇，4保存。快速液相层析（快速液相层析（离子交换层析,mono Q;monoS）：用于聚焦用于聚焦层析（mono P)盐析 有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、等电点沉淀法l调整pH至酶的等电点。原理原理：溶解度随分

15、子引力加大而减小，其他条件相同，只pH在等电点附近,分子引力最大，蛋白质就沉淀。一般不单独使用，配合其他方法使用。l盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上所带的电荷而使溶解度提高。l盐析：离子强度提高到超过某一数值，带电分子将会沉淀下来。特点：特点：1.最古老最古老,但应用广但应用广 2.常用常用NH4)2SO4，因为溶解度大因为溶解度大 0时，时，(NH4)2SO4溶解溶解706g/L;25时，时，(NH4)2SO4溶解溶解767g/L;在在 0时也能把几乎所有的蛋白盐析出来。时也能把几乎所有的蛋白盐析出来。最好用分析级盐析 从55%开始有沉淀析出 65%时有50%沉淀 75%时有7080%沉

16、淀 100 蛋 白质 50 浓 度 0 20 40 60 80 100%(NH4)2SO4浓度(以百分饱和度表示)蛋白质浓度1）小样试验：盐析常数:由蛋白质性质、盐种类决定 log S=-KI 盐析常数离子强度 蛋白质溶解度 是蛋白质在纯水中(I=0)S的外推对数值 与蛋白质种类、溶液、温度、pH决定2）成功的关键：pH=等电点（pI）蛋白质浓度 1000ug/ml,沉淀快主要用于分级沉淀，在 0左右进行。常用(NH4)2SO4 ，溶解度大，T影响小。操作方式操作方式：常用加饱和(NH4)2SO4溶液或加固体（NH4)2SO4 缺点：脱盐（对浓盐溶液透析），分辨率低。优点：简便、安全、重复性高

17、。l 加与水相混的有机溶剂，改变溶液介电常数，增加蛋白质间静电作用力，减弱蛋白质与溶剂分子之间的作用，导致蛋白质聚集而沉淀。另一作用脱水。1)温度 0下操作。常用丙酮,还有甲醇,乙醇等，有机溶剂先在-1520下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。2）pH=pI 3）I 常加510%(NH4)2SO4，以提高分离效果，I 0.05 M 可以提高分辨率和酶稳定性4)沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。优点:分辩率高且易去除，与pI 同时使用，用于酶粗分缺点：对有机溶剂不稳定的酶，容易变性。多聚电解质多聚电解质聚丙烯酸（PAA）等杂多酸，在低浓度时，选择性地与某种（某类）酶络合沉淀。作用机制还不

18、清 PAA+酶溶液（酶+杂蛋白）溶菌酶，蛋白酶等 （PAA-酶）沉淀 +Ca+酶酶 在溶液中在溶液中 +SO42 PAA+Ca SO42 沉淀 成功关键是成功关键是PAA的分子量的分子量 利用离子聚合物（利用离子聚合物（SDS），），非离子非离子聚合物聚合物(聚乙二醇，聚乙烯亚胺，单宁酸聚乙二醇，聚乙烯亚胺，单宁酸)等，等，在一定条件下与蛋白质直接或间接在一定条件下与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质，酶一起沉淀，形成络合物，使蛋白质，酶一起沉淀，再用适当方法把酶溶解下来再用适当方法把酶溶解下来。PEI（聚乙烯亚胺）+菌体超声上清液（酶）0.2M KCl(DNA)-PEI-杂蛋白质和酶）沉淀

19、 0.6M KCl EcoRI(酶)被溶解下来+(DNA)-PEI-杂蛋白沉淀，不溶解 为水溶性非离子型聚合物，方法同(NH4)2SO4,但与PEG分子量有关系。优点优点：PEG对蛋白质活性构象起稳定作用。缺点缺点：PEG分子量大，溶液粘度大，操作难。分子量小，用PEG多才能使蛋白质沉淀，PEG用后，要去除；PEG价格很贵，不太用于大量样品。常用PEG4000，6000。一般蛋白质浓度在10mg/ml以下，控制pH=p I，T=20。PEG以固体或50%液体形式以上方法基本上是“固液”分离方法。“液液-液液”分离纯化分离纯化：酶，杂蛋白都在液相中。液相包括一相或多相，但不相溶。K=C上上/C下

20、下 分配系数不同分配系数不同，酶和蛋白质的介电常，酶和蛋白质的介电常数介于数介于0.11.0之间。之间。优点优点：比较适合大量样品分离。缺点缺点：成本高，去除液相成分困难。l亲和色谱l亲和洗提原理：酶的底物或竞争性抑制剂通过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体。当混合物通过亲和载体时，酶由于与底物或竞争性抑制剂之间有特异性相互作用而保留在柱子上，其他酶和杂蛋白被洗出柱子。然后加入底物进行竞争，或改变pH或离子强度使结合的酶解吸。问题：（1）亲和载体的制备较难；（2）亲和载体与酶的特异作用减弱或丧失；（3）亲和载体和酶之间的相互作用强度必须落在一个正确的范围以内；（4）如果催化反应体

21、系中有两个底物，会产生一些特殊问题。相互作用的特异性表现在从色谱的支持材相互作用的特异性表现在从色谱的支持材料解吸这一阶段。料解吸这一阶段。酶和其它化合物一起先吸附到一种离子交酶和其它化合物一起先吸附到一种离子交换剂上，再用适当的底物特异地洗提。换剂上，再用适当的底物特异地洗提。特点：（特点：（1）不需要将配位体与载体相连；）不需要将配位体与载体相连；（2）可采用高窜量的柱子。）可采用高窜量的柱子。亲和层析亲和层析：原理原理：层析柱的层析柱的固相载体上通过结合了专一与酶分子上特殊基固相载体上通过结合了专一与酶分子上特殊基团结合的团结合的配基配基（底物，颜料、抑制剂等（底物，颜料、抑制剂等)，酶

22、通过层析酶通过层析柱时，酶可以专一地被柱时，酶可以专一地被配基配基通过非共价键结合，非专通过非共价键结合，非专一结合的杂蛋白被洗涤下来。通过改变洗脱条件，酶一结合的杂蛋白被洗涤下来。通过改变洗脱条件，酶又被解吸下来。从而达到分离的目的。又被解吸下来。从而达到分离的目的。步骤：1制备亲和层析柱，或买或自备Sepharose 4B 用BrCN活化，使载体可以通过共价键结合牢配基2选择合适的配基，进行偶联 3去除未偶联的配基 4选择合适的缓冲液平衡亲和层析柱 5上样，象一般的柱层析一样 6洗涤,去除未不亲和的杂蛋白，非专一性吸附物 7把酶洗脱下来 8亲和柱脱盐，再生，换成可再亲和吸附的状态。注意：载

23、体载体结构松,亲水,有大量与配基结合的基团，经得起反复操作时的强度和pH、I、T的处理配基配基与酶有的亲和力：Kass 配基 +酶 配基酶 Kdiss 10 4 M Kdiss 10 8 M 或者 104 M Kass108 M 要有供偶联固定的活泼基团，又能与载体结合，配基的结合量在 20umol/ml，有时还要接臂，以改善亲和吸附效果。上样量上样量 按吸附力大小，吸附力大，样品量大些。样品量控 制在柱体积的5%以内。蛋白质浓度不要超过30mg/ml，流速约10ml/cm2.h。洗脱方法选择洗脱方法选择:改变温度，离子强度，pH，改变溶剂系统，电泳，例：Sepharose 4B CNBr 在

24、碱性条件下活化，并洗去多余的CNBr 偶联S.aureus 细胞壁肽聚糖 洗去未偶联的S.aureus 细胞壁肽聚糖 用样品同样的缓冲液平衡柱，并上样和洗涤，改变上样时条件，把吸附的Lysostaphin洗脱下来 吸附：吸附：物理吸附物理吸附 白土，氧化铝，磷酸钙胶等。如0.0050.01M,pH5.06.5磷酸缓冲液吸附提 高缓冲液pH，把吸附的酶洗脱下来。羟基磷灰石羟基磷灰石 为微晶型磷酸钙制品，钙离子与蛋白质的 负电性基团相互作用。磷酸基团与蛋白质的正电性基团相互作用。洗脱可以用阶梯或梯度洗脱洗脱可以用阶梯或梯度洗脱 如在0.001M磷酸缓冲液pH6.8平衡液中进行，吸附一段时间后，提高

25、离子强度到0.010.5M磷酸缓冲液选择性热变性选择性热变性：加热到一个酶稳定的温度条件下)，使不稳定的杂蛋白变性沉淀，消除杂蛋白方法举例方法举例：准备好沸水浴-蚯蚓纤溶酶均浆液迅速放入 -到达变性温度55，保温1h -取出，冷水冷却 -离心 选择性热变性选择性热变性 选择性酸碱变性选择性酸碱变性 选择性表面变性选择性表面变性蚯蚓纤溶酶 总蛋白mg 总活力比活力 纯化倍数 回收率原液 716.7 2472.5 3.45 1.0 100 热变性 268.6 2620.8 9.76 2.83 106TI-agarose 4B 17.57 2338 133.1 38.6 96.6DEAE-cellu

26、lose 5.68 1063 187 54.4 43.9Arg-agarose 4B 0.85 531 622 180.6 21.9 酸碱变性酸碱变性：酶和杂蛋白受到酸碱影响程度不同，如细胞色素C 可 用2.5%三氯醋酸处理，大部分杂蛋白就可以去除。如麦芽中提取-淀粉酶，pH3时时-淀粉酶失活,无活性。缺点缺点：操作繁，纯化效率低。表面变性表面变性：酶溶液和惰性液体（氯仿）混合振荡，造成选择性表面变性。一般上层为未变性蛋白，中间层变性蛋白，下层为氯仿。操作要点：处理时间不要过长，防止酶蛋白的变性。当酶达到当酶达到一定纯度和浓度后一定纯度和浓度后，加入晶种，加入晶种，在一定在一定条件下条件下，经

27、缓慢的过程，使酶的溶解度降低，经缓慢的过程，使酶的溶解度降低，酶慢慢结晶出来。酶慢慢结晶出来。结晶成功关键结晶成功关键1浓度要在浓度要在15%为宜。为宜。2纯度要高。纯度要高。3酶要有活性酶要有活性先：选择性变性选择性变性 去除大部分杂蛋白。中间:吸附法吸附法 减少体积。或盐析盐析 脱盐，最好放后一些，可免脱盐 有机溶剂沉淀 如体积大，可放前面使用。后：离子交换,胶过滤，一般不能用大体积，操作 聚焦层析,亲和层析 有难度，可在后面用最后：结晶 要有一定纯度和浓度，放在最后3.5 3.5 酶纯化步骤的设计酶纯化步骤的设计1 1）切记酶是蛋白质，防止酶失活变性）切记酶是蛋白质，防止酶失活变性 a.

28、低温 b.一般中性，10不稳定,局部酸、碱过高 c.蛋白变性（操作时形起泡沫）d.重金属,有机溶剂,微生物及蛋白酶污染 2 2）手段可激烈一些）手段可激烈一些 3 3）踪酶分离每一步的总活力和比活力，判别每步）踪酶分离每一步的总活力和比活力，判别每步方法的可行性。方法的可行性。3.5.1 酶分离纯化的基本原则3.5.2 选择纯化方法时注意事项（1）试样的体积、酶和杂质的数量、pH及离子强度。（2）酶的物理化学性质：大小、等电点、溶解度、亲水性（3）需要纯化的酶的生物学性质：稳定性、辅助因子3.5.3 分离方法的顺序选择l试样量由大到小l分辨率由低到高l酶的回收率由低到高初初 步步 纯纯 化化选

29、择性纯化选择性纯化进一步纯化进一步纯化检查纯化的进展情况检查纯化的进展情况有机溶剂、硫酸铵沉淀、磷酸钙分级吸附、亲和色谱、超滤离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、聚焦色谱、疏水色谱SDS-PAGE电泳、等电聚焦纯化方法的组合纯化方法的组合：先：选择性变性选择性变性 去除大部分杂蛋白。中间:吸附法吸附法 减少体积。或盐析盐析 脱盐，最好放后一些，可免脱盐 有机溶剂沉淀 如体积大，可放前面使用。后：离子交换,胶过滤，一般不能用大体积，操作 聚焦层析,亲和层析 有难度，可在后面用最后：结晶 要有一定纯度和浓度，放在最后几个环节几个环节：预处理-抽提-浓缩-纯化-酶的制品（1）预处理）预处理 目的：

30、酶从生物样品中拿出来 动、植物组织组织糜 绞肉机切碎，高速组织捣碎机，局部高温 加沙研磨，注意吸附 破壁破壁：均浆器，冷热破壁法 丙酮干粉丙酮干粉：使用0磨碎 加-20丙酮预冷 1 5V 过滤低温干燥研磨过筛 优点优点：破壁，去脂肪和水分，节酶溶解 缺点缺点：有机溶剂不稳定，小心酶失活，注意低温注意低温 细菌：量少-超声波，溶菌酶 量多-丙酮干粉 自溶法：一定温度，离子强度下保温，或加甲苯，使菌体自溶液化 ：引入细胞其他成分，成分复杂，使分离酶失活破坏 霉菌：机械剪切，磨碎，细胞壁用溶菌酶 酵母：自溶法 蜗牛酶 冷冻破壁法（2）抽提抽提 a.普遍抽提b.选择性抽提 pH：酸性蛋白-碱性溶液 碱

31、性蛋白-酸性溶液 盐盐：低盐溶液有利于酶蛋白溶解 0.020.05 M磷酸缓冲液，0.15M NaCl 用柠檬酸钠螯合金属离子，切断与其他物质结合温度温度：0 4 之间，有的可以高一些（室温）其他其他：防止氧化-加CySH,DTT,巯基乙醇;防蛋白酶水解，加蛋白酶抑制剂(如苯甲磺酰氟（PMSF）)等；防止有机溶剂的影响（3）浓缩浓缩 大体积 小体积A)蒸发蒸发 减压蒸发-加热把水分蒸发 产生泡沫，有增色效应，效率低 超蒸发-暖空气流通过冷酶溶液表面,加速蒸发 效率低，有增色效应，用的少。效率低，有增色效应，用的少。B）薄膜浓缩薄膜浓缩：酶溶液呈薄膜状,水分子蒸发，酶溶液温度不高 优点：优点：对

32、热不稳定的酶十分有利 缺点：缺点：有增色效应 工业上应用 C）超过滤超过滤：用微孔超滤膜进行，水分子和小分子可以透过膜，大分子被阻截。优点优点：没有：没有 I 、pH、热的变化问题。热的变化问题。起浓缩和粗分作用。起浓缩和粗分作用。D)凝胶过滤：凝胶过滤：葡聚糖葡聚糖Sephadex G 25，G 50，干粒状吸水膨胀。小分子及水分子进入胶内，酶和大分子在胶外，达到浓缩分离的目的。方法方法：酶溶液中直接放入干胶，胶吸水膨胀，达到浓缩分离的目的。优点：没有优点：没有pH，I 变化，条件温和。变化，条件温和。E)冷冻浓缩：冷冻浓缩：温度 0时，水结冰，移去冰块，酶不结冰。冰冻方法：冰冻后，在室温下

33、溶化。酶先溶解1/4体积时倾出水分。F)聚乙二醇聚乙二醇：适合于少量样品，而且成本高（4）分离纯化）分离纯化 实质：在抽提（浓缩）溶液中，其成分多而杂的情况下，要去除需要分离的酶以外的组分，从而获得高纯度的酶液。存在复杂性复杂性：1）有大分子（蛋白质，目的酶和其他酶等）如核酸核酸：加鱼精蛋白，聚乙烯亚胺等，如粘多糖粘多糖：醋酸铅，单宁酸等 2）小分子，纯化中自然去除（5）酶的纯度与鉴定酶的纯度与鉴定酶的纯度（酶蛋白的均一性）多种方法相互验证多种方法相互验证。可作研究对象，或作实验和生产用试剂。不同的用途要求的纯度不同。1）作为静脉注射用酶就不能有热源。2）作为工具酶，无杂酶，否则不可能有准确无

34、误的切点，供基因工程工作。3）作氨基酸顺序分析用,构象测定,理化性质测定,要求就很高。具体方法：如内切酶方法 过量酶去切DNA，然后电泳，出现应该出现的酶切片段，图谱又窄背景又清晰。再用连接酶连接，出现条带。再酶切，出现上一次的结果 表示酶是纯的，没有外切核酸酶和单酯酶。怎样才算纯？绝对标准没有。凝胶过滤，凝胶过滤，SDS-PAGESDS-PAGE，超离心沉降速度，超离心沉降速度，沉降平衡法，末端氨基酸分析，免疫学性质研究沉降平衡法，末端氨基酸分析，免疫学性质研究测定试样中酶的活力测定试样中酶的活力和蛋白质浓度和蛋白质浓度计算比活力计算比活力制作纯化表制作纯化表酶单位酶单位/mg蛋白质蛋白质Page 58l蛋白质变性：改变pH、Tl辅助因子被除去l每一步的最佳条件和各步间的最佳配合每一步的最佳条件和各步间的最佳配合