核磁共振技术在药物分析及体内药物分析中的应用

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1、NMR 在药物分析及体内药物分析中的应用摘要：本文结合核磁共振及核磁共振光谱法的相关概念，对核磁共振光谱分析法的特点 及其在药物分析鉴定及体内药物分析中的操作，以及技术优势进行了分析，并通过实例 分别展示了核磁共振技术在药物分析和体内药物分析中试验方法多，信息丰富和定量分 析方法灵活等技术特点。说明了 NMR在药物分析及体内药物分析中的重要作用。关键词：核磁共振；定量分析法；药物分析；体内药物分析一. 核磁共振光谱法简介在强磁场的诱导下，一些原子核能发生核自旋能级裂分，当用一定频率的电磁波照 射分子时，便能引起原子核自旋能级的跃迁、这种原子核在磁场中吸收一定频率的电磁 波，而发生自旋能级跃迁的

2、现象，称为核磁共振(NMR)。以核磁共振信号强度对照射 频率(或磁场强度)作图，所得谱图称为核磁共振波谱(NMR spectrum)。利用核磁 共振波谱来结构测定、定性及定量分析的方法称为核磁共振光谱法(NMR spectroscopy)。 核磁共振以强大的结构解析能力确定了其在现代仪器分析中的地位，而共振谱线强度与 谱线诱发核子个数成正比是核磁共振实验设计和核磁谱学结构解析的重要依据之一。药 学既是推动核磁共振进步的推手，更是核磁共振技术发展的最大受益者。二核磁共振光谱分析法在药物分析中的应用1. 核磁共振用于药物鉴定分析具有以下优势2：1.1样品制备方法简单：NMR样品预处理环节少，便于质

3、控，因为制样成本低、样品污 染和丢失的风险小；1.2鉴定和检测的同步性:在一些常规药物分析检测过程中物质的鉴定和定量检测是两 个分立的环节，而NMR实验可以同时提供物质结构和含量信息，制备一个样品即能完 成对样品中物质的鉴别和含量的测定，因而核磁共振技术是一种高效快速的检测手段； 1.3对有机物的普适性：核磁共振实验是一种无偏向性的测试方法，可以实现混合物中 多个组分的同时鉴定分析，为定量分析中基准物的选择提供了较为宽松的空间；1.4异构体分析能力强：核磁共振对异构体独特的识别能力是许多测试技术所不能比拟 的。此外，作为一种“无损伤”和低消耗的检测技术，核磁共振测试过程中除了样品制备 试剂之外

4、，几乎不需要其他额外耗材，且样品可以无损回收，因而核磁共振属经济型和 环境友好型检测技术。2. 定量和定性分析方法：NMR图谱中，可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰 高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数；而共振峰面积或峰高是定量分析的依 据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时，一般只对该化合物 中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的 峰面积进行比较，即可求出其绝对含量。当分析混合物时，也可采用其各个组分的各自 指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较，然后求得相对含量。因此，在测量峰 面积或峰高以前，必须了解化合物的各组成基

5、团上质子所产生共振峰的相应位置，也就 是它们的化学位移值(值)，并选择一个合适的峰作为分析测量峰。3. 常用的NMR定量分析方法有：3.1内标法(绝对测量法)：在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，进行NMR光 谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰(即吸收峰)面积与由内标物质指定基 团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对 重量(Wu)可由下式求得：口代二舛七/ AjEWs 弋严叫巩 A巩 式中： Au为样品测得和峰面积(不少于5次测定的平均值)；As为内标物测得的峰面积(不少 于5次测定的平均值)；EWu为样品在该化学位移处的质子当量；EWs为内标

6、在该化学 位移处的质子当量。若样品重为W,则百分含量=Wu/W X100% 对内标物要求： (1)最好能产生单一的共振峰，在扫描的磁场区域中，参比共振峰与样品 峰的位置至少有30Hz的间隔；(2)应溶于分析溶剂中；(3)应有尽可能小的质子当量(EWs)； (4)不应与样品中任何组分相互作用。常用的内标物有：苯或苯甲酸苄酯(在5.3ppm处， 由c6h5cooch2-c6h5中的-CH2所致)，适用于非芳香化合物；马来酸，适用于非链烯 型化合物。3.2 相对测量法：当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。 操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收

7、峰面积 (A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较，然后按下式计算 样品与该杂质的相对百分含量：样品的相对百分含量=(A1/n1/(A1/n1)+(A2/n2)x100%式中，n1和n2是指定基团的质子数。本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。3.3 外标法：欲测样品中某一组分的含量，可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度 的标准液，使样品液浓度在其范围内，然后进行NMR测定，由所得图谱中某一指定基 团上质子引起的峰面积对浓度作图，即得标准品的校正曲线。在平行条件下，测定样品 溶液组分指定基团上质子的峰面积，即可由校正曲线求得样品的浓度。3.4峰高或峰位测量

8、法：结构相似的混合物样品(如互为异构体)，由于其NMR峰分离 效果不好，用峰面积定量法不能精确测定，误差较大，此时可考虑采用峰高测量法或峰 位测量法。3.4.1峰高测量法：是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比，各组分之间的峰高比只取 决于样品的百分组成，而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时，先用 异构体I和II的纯品配成溶液，再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知 两异构体的吸收峰互不干扰；可测出各自峰高。两者摩尔数M+M=1,若两者的峰高 为 H和 ,贝V： H=MXC= (1-M) CI ； HII=MIIxCII ；两式中，CI 和 CII 是异构体 I 和II的

9、峰高系数，为已知，H和HII可测得。据此可求得M和M。3.4.2峰位测量法：当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时，经质子快 速交换后，原来两种组分基团的信号合并，在NMR光谱上得到单一信号，此峰的化学 位移与两组分的摩尔分数有线性关系，因此，测出混合物的化学位移，可直接求出二组 分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换，可用NMR 法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa 的化学位移(m)可按下式计算：m=b+(a-b)Xa式中b和a为纯的游离胺及其盐的化学位 移，Xa为盐的摩尔分数。以m对Xa或Xb (游离胺的摩

10、尔分数)作图，应呈直线关系。 因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物，测得其 m并作出校正曲线后，再测得未 知混合物的 m,即可由校正曲线求得Xa或Xb。4.下面以两个实例说明NMR spectroscopy在药物分析中的应用：4.1核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量：以环丙沙星、安妥沙星、卡德沙 星、加替沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和洛美沙星9种喹诺酮类 抗生素化学对照品为例，其中安妥沙星和卡德沙星为国家一类新药，采用重水，氘代二 甲基亚砜或氢氧化钠的重水溶液为溶剂，对苯二酚或顺丁烯二酸为内标，用喹诺酮母核 上的质子峰进行定量，以内标法和外标法计算含量。核磁共振法测定

11、结果与各对照品标 签示值的误差约为1 %内标法和外标法的计算结果一致，该方法专属、准确、简便、 快速，适用于对药物基准物质绝对含量的测定。4.2核磁共振在天然药物分析中的应用：以18卩-甘草次酸为原料，合成了一种新的甘 草次酸盐类衍生物一精氨酸甘草次酸，利用iHNMR、13C NMR、DEPT、iH-iH COSY、 HMOC、HMBC等ID和2D NMR技术对其碳和氢质子信号进行了全归属，并通过 与两种原料化合物核磁共振谱数据的对比，揭示了该成盐反应的作用机制和产物的结构 类型。4.3核磁共振技术在药物鉴别中的应用：USP32中，肝素钠和肝素钙用重水作溶剂， 采用1H-NMR广谱，用标准对照

12、法进行鉴别；伊诺肝素钠采用13C-NMR谱进行鉴别。BP2009中促性腺激素释放激素类似物布舍瑞林和戈舍瑞林，以及人工三文鱼油均采用 NRM方法鉴别。二. 核磁共振光谱分析法在体内药物分析中的应用1优势：核磁共振（NMR ）在体内药物分析中，可用于药物及其代谢物的结构鉴定、代 谢途径归属、定量分析以及药物与内源性物质相互作用的研究等。与其它分析方法相比， 具有如下优点：简便性，无损伤性；连续性；高分辨性；多目标性。2.应用：1H-NMR已广泛用于体内药物分析。已报道的有：氨苄青霉素、布洛芬、硝苯 地平、阿司匹林、美西律等的体内样品分析。Connor等用高分辨1H-NMR （400MHz） 研究

13、了大鼠静注羟氨苄青霉素后24h内尿样中药物的代谢情况。实验用自旋回波技术， 消除内源性物质的干扰，增强了测定的灵敏度。尿样中共振信号在0.51.7ppm范围内 的两组峰为青霉素结构噻唑环C2上的一对偕甲基信号，分辨清晰，测得主要代谢物为 5R，6R和5S，6R青霉素与二酮哌嗪。Murphy等用质子去偶及NOE增益19F-NMR监测接受化疗病人的肝脏中5-FU及其代谢 物（FBAL）。Campbell等利用NMR无损伤特性及表面线圈技术，测定了不同剂量抗 菌素3-氟甲基青霉素V衍生物在活体SD大鼠体内的药物浓度。将静脉注药后的麻醉鼠 置于表面线圈中，用19F-NMR测定鼠膀胱内尿样及胸内药物浓度

14、。Ogiso等用13C-NMR探讨了脂肪酸对普萘洛尔透皮吸收的影响。实验结果表明：与月桂 酸酰胺及甲酯化合物相比，与月桂酸对普萘洛尔透皮吸收的增强作用显著。普萘洛尔制 剂中加入月桂酸后，血浆中普萘洛尔浓度明显提高。三. 结论核磁共振法以其重现性好、特征性强等优点已成为药物研究的重要手段。随着天然药物 生产领域的发展，核磁共振作为质量控制的手段已得到重视，并逐渐地应用于实践。总 之，核磁共振无疑会给天然药物研究带来巨大的推动作用。参考文献1 吴立军.有机化合物波谱解析M .北京:中国医药科技出版社,2009:117.2 邓志威，李璟，许美凤，等.核磁共振技术在药物分析鉴定中的应用J.分析测试学报,2012,31(9):1081-1088. 胡敏,胡昌勤，刘文英.核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量J.分析化学,2004,32(4):451-455.4王大志，张书瑜,魏荣.核磁共振波谱在天然药物领域中的应用J.首都医药.2003.32(8):57-59.杭太俊.药物分析M.北京：人民卫生出版社,2012:81.