Western Blot为什么必须要用内参

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1、WesternBlot为什么必须要用内参？一、背景：GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，由4个3040kDa的亚基组成，分子量146kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Westernblot蛋白质标准化的内参。GAPDH检测。WesternBlotting(检测条带大约在36kDa,稀释比例达10,000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。注:因为GAPDH作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样

2、品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。反应：抗GAPDH单抗(clone6C5)能够与鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。应用：GAPDH检测。WesternBlotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。BCDEF图示:抗GAPDH单抗(Cat#KC-5G4)检测心脏组织匀浆中的GAPD

3、H水平。A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。抗GAPDH单抗稀释比例为1：10，000，HRP羊抗鼠二抗(Cat#KC-MM-1302)稀释比例为1：1000。采用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKit试剂盒及X胶片曝光显影。摘要：要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是WesternBlot。因为WesternBlot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候WesternBlot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦一一做不出结果啦、假阳性啦、

4、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)，空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)，已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做We

5、sternBlot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果即便有结果也可能影响结果的分析。内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用WesternBlot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参照(InternalControl)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WesternBlotting实验中，除

6、了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。在国外发表的文章中，WesternBlotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的

7、干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Westernblotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB

8、过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以

9、先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行WesternBlotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。上海康成生物工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH,100卩1一支，浓度为100卩g/lOOyl,稀释

10、比达1：10000以上，至少可做100次Westernmini-blots，价格仅为988元人民币，并且只需4C保存运输，有效期长达两年。这一产品大大降低了内参的费用，性能稳定、质量可靠、易于保存。在WesternBlotting实验过程中，由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的某些免疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。因此，上海康成生物工程有限公司推出了HRP标记的GAPDH，在任何情况下使用它都能够得到单一的条带结果，使得内参的使用方法更为简便准确。这种操作省时，无需二级抗体反应的HRP标记的GAPDH内参不仅具备康成生物普通GAPDH的所有优点而且结果条带单一，可避免二级抗体的非特

11、异性反应。售价为1498元人民币100卩1,稀释比达1：10000以上，至少可做100次Westernmini-blots。40I!3020-W6050-KD2D0-1;-10080-markerABCDEFGlGAPDH图示：A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白（上样量50ug）,兔抗小鼠Akt抗体（康成生物Cat#KC-5A01）检测心脏组织匀浆中Akt水平。加入兔二抗（康成生物Cat#KC-RB-035，稀释比例为1：5,000）时同时加入HRP标记的抗GAPDH单抗（稀释比例为1：10,000,康成生物Cat#KC-5G5）0采用化学发光试剂盒（康成生物Cat#KC-420）及X胶片曝光

12、显影。一次反应即可同时检测目的蛋白（Akt）与内参GAPDH的含量。目前，市场上供应的其他内参则均需要-20C保存，干冰运输：Sigma公司的Anti-卩-Actin,价格为241美元200gl,可做100次左右的Westernmini-blots。Labvision的卩-Actin399美元1ml,可做50到100次Westernmini-blots;209美元0.5ml,可做25到50次Westernmini-blots。CellSignalingTechnology的BETA-ACTINANTIBODY只可做10次Westernmini-blots,美金价为150美元,人民币售价为187

13、5元。附：在WesternBlotting实验过程中使用内参的方法有：一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。二、

14、要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是WesternBlot。因为WesternBlot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候WesternBlot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是

15、当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做WesternBlot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。内参即是内部参照（InternalControD,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（HousekeepingProteins）,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表

16、达水平变化时常用它来做参照物。在WesternBlotting实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用WesternBlot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础,特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析,所以需要内参。在国外发表的文章中,WesternBlotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是,国内仍有不少科研人员在We

17、sternBlotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是

18、敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Westernblotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。在W

19、esternBlotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种。第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可；第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。第三种，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及

20、显色。常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletalmuscleactin、alpha-cardiacmuscleactin、alpha-smoothmuscleactin和gamma-smoothmuscleactin,其余

21、两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(询on-muscle)和gamma-non-muscleactin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性(好像是对于上样量20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了)，但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参

22、也是可以考虑用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-boxbingdingprotein(TBP)甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最

23、常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santacruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A1978等)，ProSci(Cat#3779),CellSignaling(Cat#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有AxxoraPLATFORM(

24、PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(90%)。p-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白，选择作p-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的(尤其是做蛋白的组织表达谱时)。那么制备p-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原，可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否，而导致所制备抗体具有一定的组织特异性如选取的短肽仅在beta型存在，所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在，则此抗体除非肌细胞外，还可以检测cardiac，skeletal，smoothmuscle细胞的actin