细胞培养标准操作程序(SOP)

《细胞培养标准操作程序(SOP)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养标准操作程序(SOP)（6页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、2细胞培养标准操作程序（SOP）1目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订 实验室细胞培养操作流程.2适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员.3操作规程：3。1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3。 1.1 1000ml 培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml 烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH 仪、23 天内的新鲜三蒸水 (或新鲜反渗水)、NaHCO3 粉、1000ml 无菌玻璃瓶（100ml10 个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、23 个 过滤器、注射器。紫外线照台 30min 。2、将培养粉用 900ml 新鲜三蒸水(或

2、新鲜反渗水)溶解，并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌，按说明添加成分(如 Invitrogen 公司的 RPMI1640 配制 1000ml 需加 NaHCO3 粉 2.0g,Invitrogen 公司的 DMEM 需加 NaHCO3 粉 3.7g 等），再充分搅拌.无需加谷氨酰胺,因该培养基里 已含有.4、用 1M（1mol/L)HCl 调 PH 至 7.0 左右（细胞适宜在 PH7。27。4 生长，配制好后 PH 值会升 高 0。20.3，故配时调 PH 至 7。0 左右）。5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到 1000ml 。6、配青霉素 80 万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素 1

3、00 万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取 0。5ml 青霉素和 0。4ml 链霉素加入到 1000ml 培养液中，使其终浓度均为 100U/ml ，充分搅拌混 匀。7、在无菌操作台里用 0。22um 的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到 100ml 玻璃瓶中，玻 璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞，放-20 保存备用.注意：(1）配制培养液及调节培养液 PH 值所使用的 HCl 和（或）NaOH 均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。 一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）准备的 100ml10 个玻璃瓶必须事先高压灭菌 ！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗 水）的容器均不需高压灭

4、菌，干净即可。3.1。2 PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl 0 。2g新鲜三蒸水(或新鲜反渗水）至 1000mlNa2HPO4H O 1.56gKH2PO4 0 。2g（1) 无需调 PH 值，其成分溶解后 PH 为 7.4 ，不需除菌滤膜过滤除菌，放于 4保存，用前直接高压灭 菌(高压时,装 PBS 的瓶子的瓶盖要插针头!）(2） Na2HPO4H2O 1.56g 则 Na2HPO412 H2O 需 3。4888g（3) 如欲配制 500ml，以上成分减半即可3.1.3 0。25胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉2.5gEDTA（乙二胺四乙酸二钠) 0。3gNaCl 8 。0gKCl 0

5、。4g +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至 1000ML NaHCO3 0.5gGlucose(葡萄糖） 1.0g酚红0 。06g（1)配出来的 PH 值为 7.6，在 PH 值 7.6 7。8 范围内，故不需调 PH 值。（2）用 0。22um 的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20保存备用。4可连续使用 1 月左右. （3)用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器 均不需高压灭菌，干净即可.（4)如欲配制 500ml,以上成分减半即可3。2 细胞复苏1、准备：紫外线照台 30min,准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用

6、前 放水浴箱里温育 20 分钟。在操作台上摆放好物品,左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等,右边 放滴管架、镊子,右上角放废液缸。2、灼烧培养瓶口及瓶盖,用滴管取培养基 5ml 加入试管中(一滴约为 50ul ）。3、戴手套,从196液氮罐中取出冻存管，立即放入 37 水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动 冻存管，保证冻存管内细胞 1min 内融化。以 70酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。（慢冻快融 ）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管,800rpm 离心 2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂 DMSO，因常温下其对

7、细胞毒性大）， 弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀.往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各 80 滴和 20 滴(使 FBS 浓度为 20 ）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀，以免在培养瓶里成团,影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出,加到培养瓶中,标记日期、细胞名称，再把培养 瓶放入 CO2 培养箱.(注意 ：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几 次,使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）6、收拾所用物品、用 75% 酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。注意：(1）入细胞室前观察 CO2压力，5-7。5mPa 左右，减压器表压力不低于

8、 0.1mPa ！（2)刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让 FBS 浓度达到 20。（3）离心时间为 1 2min,速度为 800 转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。（4）滴管使用注意事项：a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用 ,防止细胞间污染。b. 培养基和 FBS（胎牛血清）可以用一个滴管,但分开用更好！c. FBS （胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管，因为血清对胰酶活性有抑制作用。d 胰酶和 PBS（平衡盐溶液)可以用一根滴管，不过最好分开（5)不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如 2 年以上）,技术不过关（如吹打 太激烈）、细胞传代数太

9、多等.（6）关于 PBS(平衡盐溶液)：a 。 PBS 溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS 高压时其瓶塞一定要插针头。b。 PBS 和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的 PBS 冲洗细胞中的杂质.PBS 虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向,故不可经常冲洗细胞。c 不温的 PBS 用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。d 消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入 23ml PBS（防止培养瓶干燥)，培养瓶放 CO2 培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把 PBS 吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即 可再用。(7)DMSO（二甲基亚

10、砜)在常温下对细胞毒性较大，而在 4时，其毒性大大减弱,故冻存的细胞复 苏后应及时洗涤冷冻保护剂 DMSO（离心后弃去上清）,防止 DMSO 在常温下对细胞产生较大毒性！3.3 细胞换液1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：a。移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生 长期时可以见到很多分裂期细胞。c。生长状态不良的细胞： 细胞折光性变弱,轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间 空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。d。只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。2、紫外线照台

11、30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基,FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时 打开照明灯和抽风机，用 75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上,从左到右顺序为：吸细 胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸 FBS(胎牛血清）的滴管.从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的 左边。3、从 CO2 培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处(注意不要把胶盖烧 焦），滴管（前端 90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸 干净。注意:滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡,且不要伸入瓶内太多，防止造成污 染；滴管尖端悬空弃液，

12、不要触到废液碗（要亲眼看到弃液,防止滴管尖端触到废液碗）!4、用吸培养基的滴管吸取培养基 90 滴加入到培养瓶（25c ）中,再用吸 FBS（胎牛血清）的滴管吸取 FBS 10 滴加入到培养瓶中。(使 FBS 浓度为 10）5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回 CO2 培养箱中。6、收拾所用物品、用 75% 酒精喷洒操作台,擦台，保持台面整洁.注意:（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操 作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开.(2）镊子每次使用前均需灼烧。装 FBS 的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后,再用其夹住瓶盖盖 上

13、;取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外,其他滴管滴加液体时都要悬空 滴加.已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。（5)培养液以没过细胞为宜。(6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液,容易增加污染机会.3。4 细胞计数1、原理：（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。（2）血球计数盘一般有二个 chambers，每个 chamber 中细刻 9 个 1mm2 大正方形，其中 4 个角 落之正方形再细刻 16 个小格,深度均为 0.1mm .当 chamber

14、上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20。1mm=1。0x10-4 为每 ml 中之细胞数目.ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数,再乘以 10 4，即细胞数/ml4 大格细胞总数 / 4104注意： 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10以上，说明分 散不好,需重新制备细胞悬液.2、计数方法:（1) 75 酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片.（2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体， 从中吸取 13ul 至盖玻片边缘(注意不要溢出,不要有气泡）。（3） 观

15、察计数:压线的记左不记右,记上不记下；成团的细胞只记为 1 个;先用低倍镜（红色，4） 找出大位置，再用中倍镜（黄色，10 ）进行计数。细胞数 /ml4 大格细胞总数/ 4104（4) 计数完毕用 75 酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。3.5 细胞传代1、紫外线照台 30min,准备好细胞培养所需物品。2、取灭菌试管 1 支，配完全培养基（含 10FBS）3ml（培养基： FBS=54 滴: 6 滴）.3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液.4、胰酶消化:加入约 1ml（20 滴）胰酶到培养瓶里消化.胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观察 培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，

16、细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入 CO2 培养箱让残存的胰酶继续消化，(在37胰酶消化效果最佳)。5、每 1min 把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮,细胞间隙明显增大时,用吸细胞液 的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基 3ml 加入到培养瓶中终止消化。6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶 口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打,用力吹打对细胞也有伤害。 新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打 5 次,靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中

17、所有细胞悬液用 吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。7、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可 以长满,待有经验后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数！）8、传代:不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照 1：5 比例进行传代.先用滴管吹打 混匀 3ml （60 滴)细胞悬液,取 12 滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基:FBS=9：1）使液体 总体积达到 4ml,平放到 CO2 培养箱中继续培养。9、收拾所用物品、用 75% 酒精喷洒操作台,擦台，保持台面整洁。注意：（1）对于难消化的细胞(如 Bxpc

18、-3 胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用 12ml（即 2040 滴，或 12 滴管）4 PBS 冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤.（2）一定要防止细胞过消化!因过消化，使细胞成团，不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和 导致生长状态差等。* 过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下 来的细胞。b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一 片片空隙。（3）过消化的处理:不吸出胰酶，立刻加入 3ml 完全培养基终止消化后一并收集入试管中，经过 800 rpm 离心 3min，弃去上

19、清（失活的胰酶、培养基、FBS)。细胞沉淀(白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹 打散细胞，重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养.（4）在加入未经 37温育的胰酶（指仅为室温)消化细胞时,即使细胞已经变圆,且透亮,用完全培养 基终止消化后仍很难吹打下来。那是因为胰酶的温度不适宜；而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到 CO2 培养箱中，放置 5min, 让胰酶在其最佳温度（37)下消化细胞。（5）把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细 胞成团不均，影响在培养瓶中生长.（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生。（7）

20、吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。(8）完全培养基为含有 10%FBS（胎牛血清）的培养液(基）。（9）小牛血清使用范围：520%，10最常用。血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速 度可减少血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些,则血清用 20 。（10）一般 25c 培养瓶需培养液 5ml,通常需 90 滴培养基+10 滴胎牛血清（FBS）,一滴液体体积 为 50ul,即 20 滴为 1ml。（11）一般细胞生长铺至瓶底约 80% ，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少 营养而状态老化,不易用于后续实验。3。6 细胞铺板(如 12 孔板)1、紫外线

21、照台 30min ，准备好细胞培养所需物品。2、在灭菌试管 1 中配完全培养基 3ml(培养基：FBS=54 滴:6 滴）3、消化同前，注意防止过消化.吹打混匀计数,如为：8.010 5个/ml4、稀释细胞悬液：根据经验，细胞密度 0.810 5个/ml 较合理，因每孔需加培养液 1ml,共需 12ml，分 2 次,每次 6ml（因试管体积有限,6ml 即 120 滴)，则配制细胞悬液： 8。010 5 个/ml 6ml,x=0。6ml即 细胞原液： 0.6ml20 滴/ml=12 滴完全培养基： 6ml 0.6ml=5.4ml （5.420 滴=108 滴）97 滴培养基+ 11 滴 FBS

22、个/ml x ml = 0。810 5故取 12 滴细胞悬液、108 滴完全培养液加入试管中.用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作.每孔 1ml(20 滴），分 4 次滴加，每次 5 滴, 按顺序依次滴入.注意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀 !6、继续稀释细胞悬液 6ml，操作同前。7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置 5min 后，在显微镜下观察细胞是否铺均匀， 如不均匀,将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液 1ml,采用 700ul 枪吹打(不能 用滴管,会刮花底面）,可以轻轻抵着底面往各个方

23、向吹打。注意 ：小心吹打，最好不要起气泡,否则会导致细胞不均，且影响观察。吹打后放倒置显微镜下观察， 若不够均匀，继续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染.8、吹打完毕后,小心将细胞板放 CO2 培养箱培养.（注意：拿细胞板避免晃动，最好直拿直放，不 要推动移动,否则细胞容易成团。）9、清洁操作台面,用 75酒精喷洒操作台，擦台。注意：(1）若铺 96 孔板,则需在 96 孔板周围一圈孔中加入 PBS，防止干燥。（2）各种不同规格板的铺板细胞数量：板型6 孔板细胞密度(孔）0。60。810 5 /ml个体积/孔2ml需细胞数410 4吹打加样枪头1ml12 孔板0.6 0。810 5个

24、/ml1ml6700ul810 424 孔板0.8 1.010 5个/ml0。5ml4510 4300ul96 孔板1.010 5个/ml0.1ml110 450ul3.7 细胞冻存1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase ）且存活率高之状态，约为 8090%致密度。2、依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞于试管中,取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度,一般冻存细胞浓度约 15106cells/ml，依细胞种类而异.3、用试管塞塞住试管，配平，800 rpm 离心 3min，去除上清液,加入适量完全培养液,使细胞浓度为 15106cel

25、ls/ml ，混合均匀。4、吸取 16 滴细胞悬液到冻存管中，再加入 2 滴 FBS，2 滴 DMSO(二甲基亚砜,为细胞冻存保护剂)， 使 FBS 浓度为 20 ，DMSO 浓度为 10%.盖紧冻存管盖,在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。5、把冻存管放到-70冰箱程序降温盒中 24 小时（勿超过 1 周），然后转移到-196液 氮罐中长期保存。注意：（1）注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色（以 0.22micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如 Sigma D2650），以 510ml 小体积分装，4避光保存，勿作多次解 冻。（2）冷冻保

26、存之细胞浓度：normal human fibroblast ：13106cells/mlhybridoma ：13106 小时后死去。cells/ml，细胞浓度不要太高,某些 hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻 24adherent tumor lines：57106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而 HeLa只需 13106cells/mlother suspensions ：510106cells/ml,human lymphocyte 须至少 5106cells/ml 。（3）冷冻保护剂浓度为 5 或 10DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时，亦应作 一个 backup culture ，以防止冷冻失败.(4)DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大,而在 4时，其毒性大大减弱，且能以较快的速 度渗透到细胞内,故冻存细胞时使用室温下的 DMSO，在冻存的细胞复温后 ,应及时洗涤冷冻保护剂 DMSO(离心后弃去上清）,防止 DMSO 对细胞产生毒性.