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1、实验二 苹果中多酚氧化酶最适 pH 的测定一、 实验原理存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。一是一元酚羟基化，二是邻-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻-二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。二、 试剂和仪器试剂：0.2mol/L醋酸-醋酸
2、钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机三、实验步骤1、从苹果中萃取多酚氧化酶将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和400mL左右预先冷冻至26的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。将所得丙酮粉转移至150 mL 0
3、.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌30 min，然后离心（4,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。2、不同pH下多酚氧化酶活力的测定在比色皿中分别加入1.81.1 mL pH为3.6的缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，搅匀后加入0.51.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400 nm下的吸光值随时间的变化，参比以缓冲液代替酶液。依次测定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0几个pH。四、数据记录与处理数据记录：pH值3.64.04.65.05.66.06.57.07
4、.58.0加酶量（mL）1.01.210OD值0.1720.166（12s）0.1600.1500.147（12s）0.115（12s）0.106（15s）0.130（11s）0.160（11s）0.15120OD值0.2140.2040.2100.1940.1490.1150.1070.1320.1620.15130OD值0.2580.2500.2580.2400.1520.1150.1090.1340.1630.15140OD值0.3000.2950.3020.2960.1560.1170.1080.1350.1650.15250OD值0.3410.3380.3480.3290.1610.
5、1170.1100.1360.1660.15360OD值0.3820.3770.3920.3730.1660.1180.1110.1370.1700.15470OD值0.4200.4180.4330.4150.1710.1210.1130.1390.1730.15680OD值0.4570.4560.4750.4550.1750.1230.1170.1430.1750.15890OD值0.4940.4940.5140.4960.1790.1260.1180.1430.1780.161100OD值0.5290.5300.5540.5340.1860.1270.1200.1450.1820.1641
6、10OD值0.5650.5670.5910.5720.1880.1300.1210.1510.1840.165120OD值0.5980.6010.6260.6070.1920.1330.1240.1510.1880.168用Excel处理数据，得到不同pH下消光-时间曲线的斜率，斜率的物理意义即每分钟增加的消光值，也即酶的活力单位数。数据处理：pH值3.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.0mL1.2mL酶活力0.23280.24100.25400.24980.02640.01020.01020.01140.01550.0098酶活mL0.23280.24100.
7、25400.24980.0220.00850.00850.00950.01290.0082用Excel作图得到下图：由酶活力-pH曲线关系可以得知苹果中的多酚氧化酶在pH=4.6时的酶活力最高，也就是说pH4.6是苹果中多酚氧化酶的最适pH。五、 讨论1、 苹果中存在着多酚氧化酶的天然底物，因此在制备多酚氧化酶提取液的过程中，快速和低温是必要的条件，否则将得到褐色的酶液。2、 丙酮可使酶蛋白沉淀下来，从而与天然底物分离，但是常温下丙酮会导致酶变性，因此必须先冷却至26。事实上，在试验中，丙酮并没有冷却到26，因此匀浆时现取现用。3、 本实验所测酶活较低，可能有两个原因，一是所选的两个苹果有一个是红苹果不是酶活相对高点的青苹果；二是在通风橱里用吹风机吹去丙酮时，所吹的风不是冷风，二是带有温度的热风，导致酶有些许的失活所致。
苹果中多酚氧化酶最适-pH-的测定
