动物细胞培养和核移技术

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1、Seminar 精卵结合精卵结合胚胚 胎胎细细 胞胞个个 体体显微操作仪显微操作仪 目目 录录一 核移植技术简介核移植技术简介二二 核移植的分类核移植的分类3 核移植的应用核移植的应用四四 展展 望望1.1 定义定义：将供体细胞核移入：将供体细胞核移入去核的卵母细胞中去核的卵母细胞中,使后者不经使后者不经 精子穿透等有性过程即可被激精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育活、分裂并发育,使得核供体的使得核供体的基因得到完全复制。基因得到完全复制。一 核核 移移 植植 技技 术术 简简 介介1 切开卵母细胞透明带切开卵母细胞透明带2 挤出卵母细胞细胞核挤出卵母细胞细胞核3 注入供体细胞核注入供体

2、细胞核4 电融合仪融合电融合仪融合5培养培养12345供体细胞核的来源供体细胞核的来源体细胞核移植体细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植供受体种间关系供受体种间关系异种核移植异种核移植同种核移植同种核移植核移植目的核移植目的生殖性克隆生殖性克隆治疗性克隆治疗性克隆二二 核核 移移 植植 分分 类类 2.1 生殖性克隆生殖性克隆2.2 克克 隆隆 动动 物物 的的 鉴鉴 定定DNA 指指 纹纹：指每个个体所特有的基因多态性：指每个个体所特有的基因多态性鉴定方法：鉴定方法：RAPD 微卫星微卫星 RFLP DOLLY的鉴定：微卫星的鉴定：微卫星 绵绵 羊羊 199

3、7小小 鼠鼠 1998 牛牛 1998山山 羊羊 2000 张张 涌涌 西北农林科技大学西北农林科技大学 猪猪 2000 兔兔 2001 大大 鼠鼠 2003 周周 琪琪 中科院动物所中科院动物所 狗狗 2005 2.3 已已 克克 隆隆 的的 动动 物物2.4 治治 疗疗 性性 克克 隆隆 细胞治疗细胞治疗 组织替代组织替代 器官移植器官移植1.细胞治疗细胞治疗2.异种器官移植异种器官移植3.生产治疗性蛋白生产治疗性蛋白4.保护濒危物种保护濒危物种5.培育各种疾病动物模型培育各种疾病动物模型三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用1 细细 胞胞 治治 疗疗三三 核核 移移 植植

4、技技 术术 的的 应应 用用1.1 定义定义 细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾病，如糖尿病病，如糖尿病;中枢神经系统疾病（帕金森，阿尔莫茨症）中枢神经系统疾病（帕金森，阿尔莫茨症）;肝功能衰肝功能衰竭竭;甲状腺疾病。甲状腺疾病。核移植核移植 消除免疫排斥消除免疫排斥 胚胎干细胞胚胎干细胞 提供细胞来源提供细胞来源三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用2005 韩国科学家韩国科学家 黄禹锡应用体细胞核移植，从黄禹锡应用体细胞核移植，从糖尿病；脊索损伤；先天性低丙球蛋白血症病人的糖尿病；脊索损伤；先天性低丙球蛋白血症病人的皮

5、肤细胞中皮肤细胞中克隆克隆出了早期胚胎，并成功提取出新的出了早期胚胎，并成功提取出新的胚胎胚胎干细胞干细胞系，系，突突 破破 克隆早期胚胎和提取干细胞的效率从克隆早期胚胎和提取干细胞的效率从 1/240 提提 高到高到 1/20。体细胞全部来自于患有各种疾病的病人体细胞全部来自于患有各种疾病的病人 遗遗 传传 疾疾 病病 的的 治治 疗疗2 异异 种种 器器 官官 移移 植植 可移植器官短缺可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应急性免疫排斥反应 基因敲除半乳糖基转移酶基因敲除半乳糖基转移酶 核移植核移植 基因敲除基因敲

6、除SPF克隆猪克隆猪 器官移植器官移植三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用3 生生 产产 药药 用用 蛋蛋 白白 目目 的的 基基 因因 转基因细胞系转基因细胞系核核 移移 植植动动 物物 乳乳 腺腺 乳乳 液液 提提 取取 目目 的的 产产 物物基基 因因 打打 靶靶 3.1 方方 法法三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用3.2 研研 究究 实实 例例 1997 年底年底,英国英国Roslin 研究所和研究所和PPL 公司通过克隆转基因体细胞，公司通过克隆转基因体细胞，获得了获得了6只整合只整合neo 或或neo 和和F2IX 基因绵羊基因绵羊,这标志着核移植

7、介导的转基这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。因技术成功问世。2000 年年,英国英国PPL公司将人公司将人AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的基因定点整合到胎儿成纤维细胞的1 原胶原原胶原(Procollagen)基因座位基因座位,而后用转基因细胞进行核移植而后用转基因细胞进行核移植,生产生产出世界首例基因打靶绵羊出世界首例基因打靶绵羊,其乳中其乳中AAT 蛋白含量达到了蛋白含量达到了650 mg/L,远高远高显微注射法显微注射法18 mg/L 的水平。的水平。2004 年，台湾培育带有治疗血友病的年，台湾培育带有治疗血友病的“第八凝血因子第八凝血因子”的体细胞克的体细胞克隆隆羊。羊。

8、2005 年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用4 保保 护护 濒濒 危危 物物 种种细胞核细胞核去核卵母细胞去核卵母细胞核移植重构胚核移植重构胚三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应 用用5 培培 育育 各各 种种 疾疾 病病 动动 物物 模模 型型应用核移植技术可以培育基因完全一致的应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型实验动物模型，为遗传学，病理学研究，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。提供良好的实验材料。三三 核核 移移 植植 技技 术术 的的 应应

9、 用用四四 展展 望望 虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在已取得了一些进展如体细胞核移植等，但也存在着一些问题。主要包括着一些问题。主要包括 核移植效率低，动物畸核移植效率低，动物畸形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理，形。这要求研究人员进一步了解核质作用机理，改进培养方式。改进培养方式。Bortvin,A.,Eggan,K.,Skaletsky,H.(2005).Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned fr

10、om somatic nuclei.Development 130,1673-1680.Buehr,M.,Nichols,J.,Stenhouse,F.(2003).Rapid loss of oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines.Biol Reprod 68,222-229.Ferguson-Smith,A.C.,and Surani,M.A.(2001).Imprinting and the epigenetic asymmetry between parental g

11、enomes.Science 293,1086-1089.Giles,J.,and Knight,J.(2003).Dollys death leaves researchers woolly on clone ageing issue.Nature 421,776.Gurdon,J.B.(1999).Genetic reprogramming following nuclear transplantation in Amphibia.Semin Cell Dev Biol 10,p239-243.Jaenisch,R.,and Wilmut,I.(2001).Developmental bi

12、ology.Dont clone humans!Science 291,2552.Rideout,W.M.,Eggan,K.,and Jaenisch,R.(2001).Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome.Science 293,1093-1098.基本参考文献基本参考文献 谢谢 谢谢 敬敬 请请 批批 评评 指指 正正三三 目目 前前 存存 在在 的的 问问 题题 及及 原原 因因1.1 核移植效率低核移植效率低1 存存 在在 的的 问问 题题 1.2 克克 隆隆 动动 物物 异异 常常 胎儿或新生儿死亡率极高胎儿或新生儿死亡率极高,极少数能全程发育的个体也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表型极少数能全程发育的个体也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表型,个别表型正常者也存在有免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形等问题个别表型正常者也存在有免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形等问题,导致克导致克 隆动物后期死亡隆动物后期死亡