孕期小鼠服用阿斯匹林后胎盘糖原组织化学的图像分析

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1、孕期小鼠服用阿斯匹林后胎盘糖原组织化学的图像分析第1O卷第3期200t年9月中国组织化学与细胞化学杂志CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMSTRYSep20lIl孕期小鼠服用阿斯匹林后胎盘糖原组织化学的图像分析孟杨王瑞绵戎诚兴郭广松(武汉大学医学院口腔解剖生理学教研室组织学与胚胎学教研室砷南医院病理室,武汉430071)摘要为探讨孕期小鼠服用阿斯匹林后.胎盘糖原含量变化与胎鼠发育异常之间的关系,蛤妊娠85天的小鼠连续3天灌服阿斯匹林(250mg/kg/d),用组织化学方法,图像分析技术定量研究第t25天和第t75天胎盘搪原的变化结果显示,第t2.5

2、和17.5天用药组海绵滋养层细胞特别是精原细胞内糖原含量与对照组相比显着减少(,J<0.00t,P<O.00t),胚胎发育异常的胎盘其糖原细胞的形态结构及糖原含量均有明显改变提示阿斯匹林可通过降低胎盘的糖原贮存.使其葡萄糖释放量下降,进而使胚胎发育过程中所必需的能量供给缺乏,影响了胎鼠的正常发育甚至导致畸形发生.关键词精原胎盘发育异常阿斯匹林组织化学小鼠GLYCOGENCONTENT1NPLACENTAOFASPIRINGAVAGEDMICE:AQuANTITATIvEHIsT0CHEMlCALSTUDYMengYang,WangRuimian,RongChengxing一GuoG

3、uangsong(DepartmentofOraIAnatomyandPhysiology,lDepartmentofHistologyandEmbryologyMedicalCoHege,WuhanUniversity;.DepartmentofPathology,ZhongnanHospita1.Wuhan430071,China)ToexploretherelationshipbetweenthevariationofglycogencontentinplacentaandthedeveIopmentalmalformationofembryos,pregnantmiceinwhichv

4、aginalplugswerefound8,5daysbeforeweregayagedwithaspirin(250mg/kg/d)for3days.Theglycogencontentinplacentawasinvestigatedbymeansofsignificantlyloweramountofglycogenwasobservedinsp0ngi0tfoph0b1astsespeciallyinthoseglycogencells,ofaspiringavagedmicecomparedwithcontrolanimals.Therewereobviouschangesinbot

5、hthemorphologyandglycogencontentofglycogencellsinplacentawhereembryosdevelopedabnormally.Itsuggeststhataspirinmightreducethestorageofglycogeninplacentaandleadtoadecreaseofglucoseliberatedfromplacentaandthusaninsufficiencyoftheenergynecessaryforthedevelopmentofanormalembryo.Thismightbeoneofthereasons

6、thataspirininterfereswithfetaldevelopmentandproducescongenita1malf0rmarioninmice.KeyWordsGlycogen;Placenta;Development;Malfofmation;AspirinHistochemistYMice阿斯匹林属解热,镇痛,抗炎类药,具有预防血栓形成,延缓白内障发生的成效,在临床上应用广泛.阿斯匹林的致畸性已为国内外学者证实:,其致畸机理的研究绝大局部集中在对胚胎正常代谢的干扰和阻碍方面,对胎盘结构和功能是否有影响那么未见国内外有关报道.胎盘是胚胎与母体进行物质交换,并有内分泌功能的器

7、官,胎盘发育不良可致胚胎宫内发育缓慢,妊娠性疾病的发病率及胎312中国组织化学与细胞化学杂志第10卷儿和母亲死亡率升高.我们以往的实验说明,阿斯匹林可通过损伤胎盘组织结构,干扰其屏障和内分泌功能,延缓胚胎生长发育,导致畸形发生.另有研究显示,胎盘除具有物质交换,屏障和内分泌等功能外,另一重要功能是贮存糖原,在妊娠全过程中胎盘代替胎儿肝脏贮存糖原和释放葡萄糖,并调节胎儿血糖水平t.因而,胎盘糖原含量变化对胎儿生长,发育影响重大.为此,本文用组织化学方法定量研究阿斯匹林对小鼠胎盘糖原含量的影响及其致畸机理,为临床指导孕妇合理用药,提供一定的实验和理论依据.材料和方法成年昆明种雌性小鼠40只,体重2

8、92g.随机分为对照组,用药组,每组各2O只.阿斯匹林100mg临用前于研钵中,加吐温一802滴,研磨混匀,配成含阿斯匹林的8吐温一80水溶液.晚上将雌,雄小鼠按2:1合笼,次日早晨检查阴栓,阳性者为妊娠0.5天.小鼠妊娠第8.5天时,用药组灌服阿斯匹林250mg/kg/d,连续3天,对照组给等量8吐温一80水溶液.在妊娠第12+5和17.5天时颈椎脱臼法处死小鼠.取胎盘置于Carony液中固定2-5小时,经酒精脱水,苯甲酸甲酯透明,石蜡包埋,沿胎盘中线做正中矢状切,片厚6Fm,连续切片3张,分别做H+E染色,糖原显色和淀粉酶消化.用于显示糖原的切片用70酒精铺展.HE染色按常规方法进行.过碘

9、酸一shift(PAS)反响显示糖原.糖原对照切片人过碘酸之前在含1淀粉酶的0.06M磷酸缓冲液(pH5.3)中消化1小时,其余步骤按PAS反响进行.肉眼观察并记录仔鼠发育情况.IBS全自动图像分析仪测量糖原灰度值,背景灰度141.6O.每张切片随机选择5个糖原区域,测量并计算出平均灰度值,糖原染色越深,密度越大时,灰度值越低.结果1.对照组小鼠胎盘结构特点小鼠胎盘的结构与大鼠根本一致,由母体胎盘和子体胎盘共同组成.母体胎盘为含有子宫腺的基蜕膜,子体胎盘由外胎盘锥,绒毛膜和局部尿囊组成,故鼠类胎盘属绒毛膜一尿囊胎盘(Chorioallantoicplacenta).妊娠第l3天,子体胎盘已分化

10、成3层结构,由胎鼠侧至子宫基蜕膜侧依次为:迷路滋养层,海绵滋养层(图1)和巨细胞滋养层=.迷路滋养层含有丰富的子体血管和母体血窦.子体血管的分支彼此吻合成网,管壁外覆盖着少量同充质和滋养层细胞,将子体血管与母体血窦分隔,此层是母体与子体进行物质交换的所在.海绵滋养层由细胞滋养层细胞,糖原细胞及母体血窦共同组成.细胞滋养层细胞的胞体较大,呈多边形,胞质嗜碱性,一般为单核,偶见双核.细胞排列成条索状并交织成网,网眼是母体血窦胞体较小,胞质呈空泡状的糖原细胞群与细胞滋养层细胞交织排列.与迷路滋养层相比,此层血窦的数量较少,但腔隙较大(图2).巨细胞滋养层由巨细胞和少量的母体血窦组成.偶见血窦局部埋于

11、蜕膜组织内.巨细胞为体积较大的单个棱细胞.细胞形状不一,胞质弱嗜碱性.在胎盘周缘处巨细胞有23层,其他部位只有1层,有些地方没有巨细胞.临近生产时,个别巨细胞可出现桉变形,核碎裂等退行性改变.2.用药组海绵滋养层的结构改变第12.5天,少数胎盘海绵滋养层结构变化明显,局部细胞滋养层细胞的胞质嗜碱性减退,红染,棱固缩.少数糖原细胞变小,轮廓不清.第17.5天.细胞滋养层细胞变小,紧密排列成行或成团.大局部细胞问界线不清,胞质红染,核固缩,胞质/胞桉比例增大,糖原细胞减少甚至消失,血窦腔隙变窄,数量减少畸形仔鼠的胎盘,其细胞滋养层细胞呈棱形,胞体变小,排列紊乱,网眼变窄.仅少数部位有糖原细胞分布,

12、且多数糖原细胞崩溃或空泡化.3.海绵滋养层糖原含量变化胎盘糖原含量变化在海绵滋养层表现最为明显.对照组第12.5天,海绵滋养层内多数糖原细胞含丰富的糖原,细胞滋养层细胞中糖原较少或中等量,呈颗粒状(图3).第17.5天糖原细胞内糖原增多,呈块状或粗大颗粒,致使细胞间界线难以区分,细胞滋养层细胞的糖原也比第12.5天的增多,颗粒粗大,密度增加(图4).用药组第12+5天仅有少数糖原细胞散在于细胞滋养层细胞之同,个别细胞滋养层细胞含有少量糖原颗粒(图5).第17.5天,未见含块状糖原的糖原细胞群,局部糖原细胞内有糖原颗粒,细胞滋养层细胞的糖原颗粒也相应减少.吸收胎的胎盘几第3期孟杨等.孕期小鼠服用

13、阿斯匹林后胎盘糖原组织化学的图象分析乎没有糖原畸形仔鼠的胎盘中,糖原细胞几乎不含糖原,有些细胞已崩溃,形态难以识别,仅残存小碎块样的PAS阳性反响物;少数细胞滋养层细胞内含有糖原颗粒,其数目减少(图6).用药组部分糖原细胞出现抗淀粉酶的PAs阳性反响物质.图象分析结果说明,用药组胎盘糖原含量明显降低,与对照组相比差异有显着性(P<O.001)(附表).附袁阿斯匹林对妊娠中,晚期小鼠胎盘糖原含量的影响*t捡验(ttext)讨论啮齿类和灵长类(包括人)胎盘的一个重要功能是贮存糖原海绵滋养层,尤其是特化的糖原细胞是鼠类胎盘贮存糖原的主要部位胎盘存在葡萄糖一6一磷酸酶活性,可水解葡萄糖一6一磷酸

14、成葡萄糖和磷酸.此酶一般存在于能将葡萄糖释放人血流的器官,如肝,肾,小肠等-.妊娠后期胎鼠肝脏开始贮存糖原,妊娠终止时糖原含量达顶峰,但此时胎鼠肝脏内没有葡萄糖一6一磷酸酶活性.直至出生后的第1天此酶才在肝脏内出现.因此出生前,胎鼠肝脏不能释放葡萄糖,在妊娠全过程中由胎盘代替肝脏贮存糖原并释放葡萄糖.人胎盘也存在葡萄糖一6磷酸酶的活性,并在胎盘的糖类物质代谢中发挥重要作用一用药组海绵滋养层内糖原含量下降明显,可能有两方面原因:1.阿斯匹林对海绵滋养层有直接的细胞毒作用.它使细胞滋养层细胞发生胞质红染,核固缩等退行性改变致使合成糖原的能力下降此外,用药组糖原细胞数目减少,细胞崩溃或空泡化,局部糖

15、原细胞内还出现大量抗淀粉酶的PAS阳性反响物质,提示细胞内发生了异常代谢,其糖原的合成可能受到影响.2.胎盘雌激素,孕酮分泌减少胎盘的巨细胞滋养层能产生一定量的雌激索和孕酮.阿斯匹林对巨细胞的毒性作用表现在使太多数巨细胞发生核固缩,桉溶解或核空泡等退行性改变,故合成,分泌雌激素和孕酮的能力下降.雌激素除能促进子宫内膜和肌层的蛋白质,核酸合成外,还能促进糖原在子宫肌和蜕膜内沉积口,推测糖原细胞可能就是特化的蜕膜细胞,因含大量糖原细胞的海绵滋养层有30起源于母体.故雌激素和孕酮的分泌减少可能使糖原细胞内糖原量下降.小鼠胎盘的迷路滋养层是胎鼠与母体进行物质交换的场所,由糖原细胞释放的葡萄糖首先进入母

16、体血窦,与母体血液中的葡萄糖共同流入迷路滋养层并通过胎盘屏障进入胎鼠血液.阿斯匹林使迷路滋养层的组织结构受损.子体血管腔变窄,数量减少,血管周围的滋养层细胞变小.排列密集,母体血窦腔隙变窄.整个迷路滋养层的厚度降低,提示在胎盘发生过程中,迷路滋养层内子体血管发育不昆,滋养层细胞的发育受到阻碍,造成胚胎与母体阔物质交换的总面积下降与此同时,滋养层细胞出现胞质红染.胞核固缩,碎裂,子体血管的许多内皮细胞出现棱固缩等退行性改变.说明相关的细胞功能遭受严重损害胎盘的发生和物质交换等复杂的活动机制极易遭受干扰,表现为胚胎宫内发育缓慢和死亡率升高,因而胎盘正常形态和功能的建立对胚胎发育至关重要.阿斯匹林可

17、能通过破坏屏障结构和功能干扰胎鼠从母血中摄取葡萄糖,并由于起辅助作用的胎盘葡萄糖释放量下降,致使胚胎发育过程中细胞分裂,分化以及迁移等所必需的能量供给缺乏,延缓了胚胎的发育甚至导致畸形发生收稿Z00012侉回200l一05(奉文目16见第358页)参考文献1LarssonKS,ErikssonM.Salieylateinducedetaldeathandmatformationintwomousestrains.ActaPaediatScandl966555692胨丽娟,王美瑛,孙伟康等,蒿甲醚对大鼠,小鼠和兔的胚胎毒和致畸性.中国药理1984;5(2)rl183LokeYWandWbyteA

18、BotogyoftrophoblastAresterdam:Elsevier,l983jl381804孟杨,王瑞绵,戎试兴.孕期小鼠服用阿斯匹林对仔鼠生长发育的影响及胎盘改变的组织学研究湖北医科大学报1994,l5(2)ll25PadykulaHAandRichardsonDAcorrelatedhistochem314中国组织化学与细胞化学杂志第10卷icalandbiochemicalstudyofglycogenstorageintheratplacenta.AmJAnatl963;1122156TyeLM,BurtonAF.Glycogendepositioninfetalmouset

19、issuesandtheeffectofdexamethasone.BiolNeonate198038(56):265ofvasculardifferentiationantigensinthepregnantmouseuterusandtheplacentaBiolReprod1999;61(6):13938小Jl和郎,中根一穗酶组织细胞化学拄术.上簿:上海医科大学出版社,1989,l18一ii99MatsubaraS.TakizawaT,SatoI.Glucose一6一phosphataseispresentinnormalandpreeclampticplacentaltrophobla

20、sts:u1trasnuctura1enzymehistochemicalevidence.Placental999;20(1):8110HafezES.Uterineandplacentalenzymes:areviewAetaEndocr1964:46.21711RossantJandCroyBA.GeneticidentiflicationoftissueoforiginofcellularpopulationswithintheITIouseplacenta.JEmbryolExpMorphol1985f86i17712CrossJC,WebZ,FisherSJ.Implantatio

21、nandtheplacenta:Keypiecesofthedevelopmentpuzzle.Science1994266:1508图版说明图1正常小鼠胎盘迷路滋养层(L)和海绵潼养层(s).H.E染色100图2正常小鼠胎盘细胞滋养层细胞(),糖原细胞()和母体血窦(o).H.E染色400图3对照组胎盘(第12.5天)多数糖原细胞含丰富糖原(),细胞滋养层细胞含一定量的糖原颗粒().PAS反响200图4对照组胎盘(第17.5天)糖原细胞内糖原丰富,呈块状(),细胞滋养层细胞古有粗大的糖原颗粒().PAS反响400图5用药组胎盘(第i2.5天)少数糖原细胞古糖原().细胞滋养层细胞古糖原极少(

22、1it).PAS反响400图6用药组长颈畸形仔鼠胎盘(第17.5天)多数糖原细胞崩溃().细胞滋养层细胞糖原颗粒的数目减步(1it).PAS反响X400EXPLAAT1oNoFFIGURES【L)andspogl0trophoblastlayer(S).HEstaining100Fig2Normalcyt0tr0phob1astcells(),glycogencells()andmaternalbloodsinus(o).HEstaining400Fig.3Placentaofcontrolgroup(dayl25)Manyglycogencellscontainabundantglycoge

23、ngranules().Someglycogengranulesareobservedincytotrophoblastcells().PASreaction200Fig.4Placentaofcontrolgroup(day17.5)Therearemanyglycogencellsrichinglycogengranulesormasses().1argerglycogengranulesaobservedincytotr0ph.blastceils()PASreactionX400Fig.5Placentaofexperimentalgroup(dayl25)Onlyafewglycog

24、enceilscontainglycogengranules()andthereareveryfewglycogengranulesincytotrophoblastceils()PASreaction400Fig.6Placentaoffetuswithlongneckmalformation(day17.j)Manyglycogencellsdisintegrat(/X).andtheamountofglycogengranulesdecreasesincytotrophoblastcells(1it).PASreactionX4003iS国组织化与纠胞化学杂志第1c卷孟杨等孕斯小鼠服用阿斯匹林后胎盘糖原组织化学的图像分析(王丈见第31页.图说明见正丈后1【页一妻?