壳寡糖的酶法制备研究及其初步分离

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1、壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离 摘要.壳聚糖有丰富的资源，在食品、医药、环保领域有广泛的应用，但壳聚糖的分 子量大、水溶性差，限制了它的应用。壳寡糖是其降解产物，它不但保留了壳聚糖 的某些功能特性,还有良好的水溶性等特点，更具有应用价值。酶法降解是广泛使 用的降解方法,可选择特异性的切断p一，4糖苷键，反应条件温和、过程易控制, 可通过条件的控制得到不同分子量范围的壳寡糖.本课题以实验室保藏的一株产壳聚糖酶菌株朋弧螂妇sp.14l一2为研究对象，主要围绕酶法降解壳聚糖的方向展开工作，首先对菌株产酶的发酵阶段进行优化来提高酶活,继而对该酶降解壳聚糖底物的条件进行优化，然后对酶解产物进行了分析

2、检测，最后对酶解产物进行初步的分离纯化。具体研究结果如下：、采用菌体富集和诱导产酶两步法对菌株发酵阶段进行优化,菌体富集阶段优化后的培养条件为：2。葡萄糖，O%蛋白胨,014%K2HP04，0。6%KH2P4,O.1MS4,180nl100 L,3,180叩m；优化后的诱导条件为：1.5%的壳聚糖 底物诱导 。最终，菌浓度是起始条件的3倍，酶活由最初的3。5 I,/m提高到了61 U/n。2、采用单因素实验对酶解条件进行了优化。最适条件为：底物浓度%,pH55,温度65，加酶量7 Ug壳聚糖。该酶适合降解脱乙酰度居中(85%左右） 的壳聚糖。、对酶解产物进行了分析检测。通过水解产物的TLC图和

3、平均聚合度联系可得,该酶主要以内切方式随机水解壳聚糖,酶解产物为不同聚合度壳寡糖的混合物。本研究还摸索出了通过选择不同的加酶量和酶解时间得到所需分子量的壳寡糖的 方法。4、对低聚壳聚糖进行了初步分离。采用乙醇分布沉淀法对酶解产物进行初步分 离,75乙醇沉淀即可除去聚合度约为9以上的壳聚糖，7.5乙醇沉淀则可除去聚合度约为以上的壳聚糖。关键词：壳聚糖；酶解；壳寡糖；壳聚糖酶47 / 47华中农业大学ll届硕士研究生学位论文Astractoa is ich iIl naIlr a11d“a been wie叩lid in foo，edne，enVhenta protctionndus缸.uiSap

4、icatillbece liIIitd ecuSe of itsigh molecul甜w曲ts锄 o 1ubjj吼hitoligoach撕de ar tl rducts mcdgaion of citosn。C11toisacharides otoIlly reai oe缸ctional pmpeniesof hitosan， but also 嬲watersolul an omermoe val咙出le c妇eritis。En：ymai degradton fchosn i a idlyused memo,tcn split pl，一glysiic bondspcficaly觚dselec

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9、ting di任eent en:)e dosage adhydolysi tmeTe rodt ere preliminrily uredThe 75eh趴ocu remoe he citosan whose degre of oeizton was aboV .he 8。5%thao ould eoVeth ctosan ose舱ge of poyerizon aS bo 7.Key word:citosaIl；en巧mti hydrois；cIltooligocchLrids；citosansel壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离LJ1月lJ舌壳聚糖是一种天然有机高分子碱性多糖（Briza

10、P e 1。,198、胁it At a。，179）。1991年,壳聚糖被欧洲、日本等地的医学界和营养机构认定是继蛋白质、 碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质之后的第六大生命要素(魏涛等，200)。自然界中,每年都有甲壳素生成，多达100亿吨,每年通过水产加工得到的甲壳质废弃物也多达万吨（徐鑫和王静，02），怎样充分开发和利用如此巨大的资源一直是人们探索的课题。壳聚糖的开发始于2世纪0年代(谢雅明，2）。自年代起,全球形成了 对壳聚糖系列产品的研究热潮。欧美科学家对壳聚糖研究较早,日本对壳聚糖的应用主要在食品添加剂方面,美国主要从事药物开发和生产。我国从50年代开始研 究壳聚糖的生产技术和简单应用

11、，自9年代开始重视壳聚糖资源的开发研究，来 促进甲壳素壳聚糖产业的规模化。1。壳聚糖的结构与性质壳聚糖，又称脱乙酰甲壳质、几丁聚糖、聚氨基葡萄糖。由氨基葡萄糖通过.4糖苷键连接而成，首先将甲壳质用浓碱处理,然后脱去C2上的乙酰基即可得 到壳聚糖。壳聚糖的结构式见下图1.露一一挎图。1壳聚糖结构式ig一Structura Fon吐uIa ofhtosan壳聚糖可由甲壳素通过脱乙酰基反应制得,其反应式如下：华中农业大学20l l届硕士研究生学位论文十C崎O。甲壳素壳聚糖图-2壳聚糖的脱乙酰基反应ig。1-2 Deac衄Iation Reation ofCitsan甲壳素与壳聚糖没有本质的区别，只是

12、脱乙酰度不同.脱乙酰度达到55%以上， 即可称之为壳聚糖。壳聚糖，粉末状，外观呈灰白色，在稀盐酸、硝酸、醋酸等有 较好的溶解性，在硫酸、磷酸中不溶,也不溶于水和碱。脱乙酰度和粘度是壳聚糖 的两项主要性能指标.壳聚糖具有独特的物化性质，如增粘性、保湿性、金属螯合性、生物相容性等, 它还有广泛的生理功能。世界各研究机构对壳聚糖的应用越来越重视，壳聚糖在各 个领域都体现出广泛的应用价值（康战燕等,19、LJ et a1，005)。可是,壳聚糖 分子量很大,并且晶体结构紧密,只溶于某些酸性介质,这使壳聚糖的应用受到极大限制(蒋挺大，2001）。1壳寡糖的性质与应用121壳寡糖概述 壳寡糖也叫壳聚寡糖，

13、学名一1,一寡糖一葡萄糖胺，广义上讲，壳寡糖指分子量一万以下、水溶性好的低聚糖；从狭义上来说，壳寡糖指聚合度为210的壳寡糖。 壳寡糖具有壳聚糖不具备的水溶性和易被生物体吸收等诸多独特优异的功能.。.壳寡糖的制备1221化学法主要分为l降解法、酸降解法、氧化降解法。 (1)NaN02降解法2壳寡糠的酶法制各分析及其初步分离该法是传统的化学降解法,可调节NaN02的用量和反应时间来控制产物的分子 量。该法主要用来提取单糖，缺点有以下几点:产品不纯，分布宽，均一性差,且 破坏了提供良好生物相容性的氨基。(2)酸降解法 早在5年代就有酸解法降解壳聚糖的报道。主要包括酸.亚硝酸盐法、盐酸降解法和过醋酸

14、法。壳聚糖在酸性环境下性质不稳定，溶液中不稳定，长链易发生水解 反应而导致糖苷键断裂，形成的片段很多，并且分子量不均一。过醋酸法则是将过醋酸加入到壳聚糖的乙酸溶液中进行降解，产品可以长期保存，特别适用于食品及化妆品等领域的应用。，（）氧化法强氧化剂在酸、碱条件下都可以使壳聚糖分子结构中的糖苷键发生氧化断裂. 在日本，氧化降解法已用于工业化生产,但反应的稳定性和重复性较差。2.2物理法微波法在反应的过程中，脱乙酰和糖苷键的断裂同时进行，可降低用碱量从而降低成本,缩短生产周期.丫-射线法原理是使用低剂量的辐射就能让壳聚糖的糖苷 键发生断裂，粘度大幅降低。超声波法反应温和，当辐射光波长小于360 I

15、IIl时降解 较明显。不过以上方法都有不足之处,例如：微波法和P射线法易发生交联反应；超声 波法需要在很稀的溶液的状态下进行。1。23酶解法物理化学降解法具有降解产物分子量分布范围大、均一性差、反应剧烈，易发生副反应等缺点.而酶法降解可以具有选择性，能通过控制加酶量、酶解时间等因 素控制降解产物的分子量,酶解法能完全克服化学和物理法的缺点，因此酶解法是 一种较为理想的降解方法。酶解法分为专一性酶和非专一性酶两种。（1）专一性酶降解法 （a）溶菌酶:溶菌酶能在微酸性条件下迅速降解壳聚糖的大分子链,使平均分子量下降，因此溶菌酶酶解法是制备医药用低聚壳聚糖的有效手段。溶菌酶的作用机 理是断裂连接D一

16、氨基葡萄糖和乙酰基氨基葡萄糖的。1,4糖苷键(马如,20）。3华中农业大学20 I届硕士研究生学位论文（b)几丁质酶：赵光远将大豆种予经壳寡糖处理发芽，大豆种子巾几丁质酶活力 提高了46倍，后对大豆种子中的几丁质酶进行了初步纯化,纯化的几丁质酶可降解壳聚糖释放还原糖且较适合降解DD值低的壳聚糖,其作用于D值71。1的壳聚糖37.5h可得到平均聚合度为45的水溶性壳寡糖，得率为4左右。（赵光远和陈海华，003）。(c)壳聚糖酶：壳聚糖酶与几丁质酶的区别在于底物不同,壳聚糖酶可降解部分 或者完全脱乙酰化的壳聚糖,不能降解完全没有脱乙酰化的甲壳素。Miyal（(夏文水， 201)利用芽孢杆菌属LC1

17、株所产壳聚糖酶,在pH值5.O条件下对壳聚糖进行降解， 后可得平均相对分子质量为100的壳寡糖。许多人从事连续制备低聚壳聚糖的工艺方法的研究，大都采用的是固定化酶与膜过滤体系偶联的技术。Jeon(JenYJ姐dKim S K，200）等于00年报道了利用固定 化酶技术连续生产壳寡糖的方法，该固定化系统能够将水解、分离同步进行。（2)非专一性酶解法 虽然专一性酶水解效率高,但目前很难获得大量而廉价的壳聚糖专一性酶,难以实现工业化生产,因此利用非专一性酶来降解壳聚糖具有很高的现实意义。目前已经发现有3多种非专一性酶可以降解壳聚糖，包括有,来自印P批D渺的半纤维素酶，彳胖唧跏玎袒，-的果胶酶、纤维素

18、酶和真菌蛋白酶以及乃砌D比册口1,鲥如的纤维素酶。这些酶从结构上看没有共同的催化基团，具体作用机制还不清楚。 周孙英等（周孙英等，03）对胃蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、纤维素酶四种酶对壳聚糖的降解的效果进行比较，其水解速度依次是胃蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、 溶菌酶。如果将这些非专一性酶按比例配合，利用酶之间的协同互补效应,可提高水解作用。HuZIlg（Hu Zallg anYuguangDu， a1。，19)将纤维素酶、蛋白酶、伍一淀粉 酶、蛋白酶同时水解壳聚糖,且运用膜分离技术将反应所得的低聚壳聚糖进行分离, 获得了3-糖.壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离123壳寡糖的应用(1)食品工业方面的应

19、用 壳寡糖的甜味、吸湿性、溶解度降低，可用来作为食品添加剂，改善食品结构,调节食品的水分活性。壳寡糖具有降低胆固醇、抗肿瘤、增加免疫力等生理活性， 日本已经生产出了多种用壳寡糖制成的保健品。利用其抗菌抑菌的作用,还可将壳 寡糖用于食品保鲜剂。金桥对壳寡糖在传统食品酸菜腌渍过程进行了研究,研究发现添加了壳寡糖腌渍的酸菜对大肠杆菌的抑制作用更加明显，且在感官质量上明显 优于传统腌渍方法得到的酸菜(金桥，20)。（2）医药方面的应用壳寡糖聚在医药方面具有较好的抗癌作用，特别是由6-8个氨基葡萄糖组成的壳 寡糖可以激活人体淋巴细胞,进而抑制癌细胞的过度繁殖（吕中明和石根勇,201）。 因此，将壳聚糖降

20、解为壳寡糖，从降解产物中分离纯化出具有生物活性的小分子壳 寡糖是非常具有现实意义的.另外壳寡糖还保持了壳聚糖的大分子生物活性，如降血压、降胆固醇、治疗烧烫伤（蒋莉等，001）、防治糖尿病(吕朋等,2001）.(3）化妆品方面的应用壳寡糖有良好的保湿增湿性能,与传统的保湿增湿剂相比，它以其优良的成膜性更具优越性；再者，壳寡糖良好的透气性不会干扰表皮细胞对毒素的排出；除此之外壳寡糖因其安全、无毒、良好的生物兼容性、抗静电性及优异的复配性能而在 化妆品领域得到广泛的应用(陈春华,00）。(4）农业方面的应用 在农业中,壳寡糖在植物生长调节剂和新型生物农药方面有广泛的应用。生物农药的作用机理体现在两个

21、方面,第一是壳寡糖本身对植物病原微生物有抑制作用 （马鹏鹏等，2001)，第二是壳寡糖可诱导植物产生抗菌性，增强植物的自身防卫能 力（何静，201)。另外，壳寡糖还可作为植物生长调节剂,对植物氨同化关键酶具 有明显的生理调节功能，可以提高植物同化N4+的能力，有利于蛋白质的生物合成 与积累,改善植物的营养品质及园艺性状可以促进植物生长。(陈惠萍,0）。华中农业大学20 I届硕士研究牛学位论文3本课题研究的目的和意义甲壳素在自然界中储量丰富,但由于其分子量大,溶解性差,使它的应用受到 了很大的局限.而低聚壳聚糖既保留了壳聚糖的某些功能特性，又有较高的溶解性, 容易吸收利用,因此具有极其广泛的应用

22、领域。低聚糖的制备方法主要有化学降解 法、物理降解法和酶解法.酶解法因其反应条件温和，无副反应，产品均一性好, 节能高效无污染而受到广泛的关注。本实验室于从土壤中成功分离到一株产壳聚糖酶的菌株施绍z脚蛔踞41.2。因专性酶酶解效率高,产物成分易分离,因此提高壳聚糖酶的酶活是壳聚糖工业化 应用的关键之一。本课题在已优化的产酶培养条件的基础上，提出新的思路方法来提高酶活,即采用菌体富集和诱导产酶两步法。 壳聚糖的降解产物是低聚壳聚糖的混合物，而壳聚糖的功能与其分子量及聚合度密切相关，因此对水解产物进行分析检测，确定它的具体成分是有实际意义的. 本研究首先通过粗酶液对壳聚糖降解条件的优化，研究出加酶

23、量和酶解时间对壳寡糖分子量的影响，便可以通过条件的控制,最后得到所需分子量的壳寡糖。壳寡糖的酶法制各分析及其初步分离2材料与方法：21实验材料。菌种本实验室期研究中筛选并诱变获得的菌株胁豳删妇p11_，华中农业大学发酵工程研究室保藏. 2。12主要药品与试剂.21壳聚糖壳聚糖A：脱乙酰度为85,粉末状，购于国药集团。 壳聚糖：脱乙酰度为9%，粉末状，购于国药集团。 壳聚糖C：脱乙酰度为%,脆片状,购于浙江金壳生物有限公司.21.2.2主要试剂（1）壳聚糖胶体溶液1 g壳聚糖，加入L02 ml/L的HCl,85水浴1012 至完全溶解，用lmol的NaOH缓慢调H5。，加蒸馏水配成一定浓度的溶液

24、。4冷藏备用。(2）DNS试剂 ，5二硝基水杨酸，溶于适量蒸馏水中，置于50左右温水中不断搅拌至完 全溶解,再依次加入10 oH(缓慢加入），00 g酒石酸钾钠，1 g苯酚,025 无 水亚硫酸钠，继续搅拌至完全溶解，定容至500 lIlL，贮于棕色瓶中，室温保藏7 d后 使用。（3）低聚糖标品D-氨基葡萄糖盐酸盐，购于sgIIl;壳寡糖标样【（GlcN）2(GcN)】，购于大连中科格莱克生物科技有限公司; （4)乙酰丙酮溶液:取乙酰丙酮。5InL，加入1 n儿Na2C03溶液至5 nlL，混匀放置（临用前配制）。(5）对-二甲氨基苯甲醛溶液（D啪A)：取DMBO.8g，加入5 n1L无水乙醇

25、和5 IIlL浓盐酸,摇匀放置。华中农ik大学0l届硕士研究生学位论文213培养基j甲液：1壳聚糖胶体溶液； 乙液：磷酸氢二钾.%，磷酸二氢钾O2，硫酸镁O4，氯化钠0.1,氯化钙0。%，酵母粉0。1%，琼脂粉4,pH 7。0:丙液：磷酸氢二钾0.14%，磷酸二氢钾006%,硫酸镁0.,酵母粉06, 蛋白胨O。06%,H 7；（1)壳聚糖固体培养基：甲液与乙液分别于121,0in灭菌后等体积混合； (2）壳聚糖液体培养基:甲液与丙液分别于12l，0面灭菌后等体积混合； (3)葡萄糖液体培养基:2葡萄糖与丙液等体积混合，115灭菌。2.1.4主要设备仪器(1）72型分光光度计上海第三分析仪器厂;

26、（2）精密H计上海罗素科技有限公司；（3）磁力搅拌器金坛富华仪器有限公司； （）H.4数显恒温水浴锅江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；(5)旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂; (6）平提式不锈钢蒸汽灭菌锅北京天来生物医学科技有限公司; （)乌式粘度计成都科析仪器有限公司；（8）icetNeus 0傅立叶变换(原位）红外光谱仪美国h姗o Ncolet公司。22分析方法22.1壳聚糖酶酶活的测定 (1)氨基葡萄糖标准曲线精确称取在105下烘干至恒重的标品氨基葡萄糖盐酸盐O863g，定容至500IlL，即为浓度8岬o也的标准溶液。按表21配成一系列浓度梯度的样品溶液, 分别量取O.5nlL各系列浓度的样品

27、溶液（浓度为0的蒸馏水作空白对照),与0.mL NS试剂混合，沸水浴 n妇，迅速冷却，在比色管中定容到10 IIl,混匀后读取50 m波长处的吸光度值，以蒸馏水为对照。以氨基葡萄糖含量(pm01）为横坐标，以OD“o与空白OD54的差值为纵坐标绘制标准曲线。8壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离(）酶活的测定(冯俊丽，004)取发酵液离心后上清1L，做适当稀释后,取稀释后酶液5mL，p5。6的 Hc-NaAc缓冲液1 n1L,1壳聚糖胶体溶液0。5 rL，3反应0 ml后煮沸终止反应，取反应液O.5m加I试剂0。5In，沸水浴5 min显色,冷却后定容至1m，测540胁处吸光值。酶液煮沸灭活,其余

28、反应同上，作为空白对照。酶活力单位定义为上述条件下，每毫升发酵液每分钟释放生成的微摩尔还原糖数。流程图如下：9华II农业大学20l 届硕士研究生学位论文 mLMdl瑚i雠s缓挣液1。O mL M韭垤眦s缓i申疆晒mL上清酶液O.5mL上清酶涟 5 mLl%或2%壳聚糖殷律溶液毒沸水浴IOm虹毒37水妻反应弼nill;加O5 m l或%壳聚塘腔体溶渡;毒拂承浴10mi矗3永浴匿应30扛lin舅定样赢心,舢懒、5 m对照样毒取05 m上演渡与O哆脚LDN试剂混台0沸承浴反应m如冷水冷帮，定容至lO翔Ll对有沉淀镌样品离心5 r，l啦、5晌善以蘸馏水馆对臻，分别测图。1壳聚糖酶活力测定方法Fig.2

29、-l De珊ntion of chito强nase ci、,i哆22。2生物量的测定发酵2h后取样1 mL，每次三个平行，450呻离心1IIlin，取沉淀，用蒸馏水混匀,定容至5 In，测600姗处吸光值。22.3还原糖浓度的测定采用3，5一二硝基水杨酸（NS)法。首先配制一系列不同浓度的D.氨基葡萄糖溶液，测定54 In处的吸光度(A540)，绘制标准曲线。然后在同样条件下测定反 应液的A“o，由标准曲线得出酶解产物中还原糖浓度(Miler 1311959）。 2.2.4酶解产物薄层层析(LC)分析l壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离酶解液在硅胶板GF25上展层，展层剂由正丙醇:水：乙酸：氨水

30、0:5：5：l组 成。茚三酮溶解在无水乙醇中，配成0%（w/）显色剂，并将其喷洒在硅胶板上,再黄于烘箱0烘烤10 min显色(LuXa ,20)。.2.酶解产物的平均聚合度的检测取1 m水解液，用DNS法测得吸光度，换算还原糖量G0.另取相同的ll 水解液，加入12 mol/H溶液 11L,置于沸水浴2 ，用适量 l/ NaOH溶 液中和，然后用蒸馏水稀释至25IIlL.取稀释后的反应液 IIl,按NS法测得吸 光度A，换算还原糖量,则其平均聚合度D25nGI0o,式中no，n1分别为 酸解前和酸解后酶解液的稀释倍数(刘琳等，2010).”，.26壳寡糖样品的数均分子量的测定 （1）标准曲线的

31、绘制精确称取在105下烘干至恒重的标品氨基葡萄糖盐酸盐32。34mg,定容至0nL容量瓶中摇匀,再取 mL并定容至100 In容量瓶中，摇匀,即得浓度为0mL的标准品溶液。精密量取标准品溶液O、1.、2.0、3O、4。0、5.O n于比色 管中,均加蒸馏水至 mL，再分别加入乙酰丙酮溶液lmL摇匀，沸水浴25nin， 冷水冷却，再加入DMABA溶液1 mL,加无水乙醇至0 Il并摇匀，6水浴保温l h.反应结束冷却至室温，以管为空白对照，在52 nm处测定吸光度值,以 氨基葡萄糖盐酸盐的微克数为纵坐标，吸光度值为横坐标,绘制标准曲线.(）壳寡糖的数均分子量的测定将酶解液的H调至，离心除去沉淀，

32、将上清倒入平皿中进行冷冻干燥得到壳寡糖粉末。称取W g冻干样品溶于于蒸馏水中并定容，取3 IIlL于比色管中，加水至 IIlL,后续步骤同标准曲线的制作，测52 m处吸光值(陈建国，006）。 将此A值代入标准曲线方程中得到单糖微克数,再除以得到单糖浓度X,代入 公式Mn_业X。V256华中农业大学 l届硕士研究牛学位论文其中Mn:数均分子量,:称取的壳聚糖粉末质量（g），V：定容的体积(nl)，：样品中壳寡糖浓度(gmL），216:氨基葡萄糖盐酸盐分子量。3实验方法2.3.产壳聚糖酶菌株胁豳聊蛔sp42发酵产酶两步法的探索2311在壳聚糖培养的条件下该菌的生长曲线和产酶曲线的测定将10In壳

33、聚糖液体培养基装于0IllL三角瓶中，接入2%（）的液体种子,于180叩m，摇床中培养6h,发酵过程中不同时间（Oh，24 h,48 h，7h）取样，并测定壳聚糖酶活力和菌体生物量.2.3.。2菌体生长和诱导产酶两步法可行性探究实验将100 L葡萄糖液体培养基装于50 lllL三角瓶中,按2的量接种，于180 印m，0摇床中培养12 ，4500印m离心10 Ilin收集菌体,转接入100IIlL壳聚 糖培养基中（均在无菌条件下操作)中继续培养。另设对照组，始终在葡萄糖培养 基中发酵。实验组和对照组每隔24h取样测酶活。23.3菌体富集发酵条件的优化 （）不同碳源对生物量的影响分别以葡萄糖,乳糖

34、,蔗糖，淀粉，玉米淀粉，红薯淀粉,壳聚糖为碳源,浓度均为2，其余培养基成分为丙液，发酵条件同2-。1,按22方法测定生物 量.（2）碳源浓度对生物量的影响 将选定碳源分别以1。5%，2.0%,.5,3.0%，3。的量加入,其余培养基成分为丙液,发酵条件同2.31，按22方法测定生物量。 （3）不同氮源对生物量的影响 分别以1的牛肉膏，蛋白胨,胰蛋白胨,酵母粉，硝酸铵为氮源，其余培养基成分为优化后碳源，及除去氮源的丙液,发酵条件同23。1.1,按22.方法测定生物量。（）氮源浓度对生物量的影响2壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离将选定的氮源分别以。1，03%，.5,07,。9,1。0的量加入，培养

35、方法同上，按.22方法测定生物量.()对生物量的影响配制不同pH 5O,55，60，6,70，75，8。0,8，9。0的培养基，发酵条件 同231,按2方法测定生物量.（6）装液量对生物量的影响 将培养基按不同装液量梯度0，150,180,200,5,3 rnL分别装入1000 nL三角瓶中,发酵条件同2.3。11，按22.2方法测定生物量。2314诱导条件的优化（1）不同诱导物对产酶的影响：“取三种诱导物，壳聚糖胶体，壳聚糖粉末，氨基葡萄糖，浓度均为%，与丙 液等体积混合，得到三种不同的诱导培养基,发酵条件同.1,转接菌体后每隔 24 取样,按2.21方法测酶活。（2）诱导物浓度对产酶的影响

36、 将选定诱导物按0.5，%，2%不同浓度配制诱导培养基，发酵条件同3.1.1，转接菌体后每隔24 h取样,按2.。1方法测酶活。 .3壳聚糖酶解条件的优化2.3.21壳聚糖酶液的制备将菌株施窿螂砌.141。2接种至100 L发酵培养基(500 mL三角瓶)中，7,130椰振荡发酵48 h，离心取上清液,即为粗酶液,4冷藏备用（谭光迅,2009）。23。2。2壳聚糖底物的预处理取15 g壳聚糖粉末，与200 I蒸馏水混合,溶胀30 in后，向其中加入 mo儿 沁35 InL，搅拌至完全溶解.溶液pH用l m的NaA调至所需值，最后用 相同p值的0。2 n0儿HA/NaAc缓冲液稀释至50 111

37、L,即得浓度为3%的不同p 的壳聚糖溶液。将得到的壳聚糖胶状液置于4冰箱中保存备用(ChoY ea12004）.23。23酶解条件的优化华lII农业大学0届硕士研究生学位论文（1）酶解时间的确定取1壳聚糖胶状液50 InL，恒温水浴加热至37,按60 /g壳聚糖酶底比加 入粗酶液，定时取样测定还原糖含量。（2）最适底物浓度的确定 按3。.方法配制一系列不同浓度的壳聚糖胶状液(O5%,%，2，3%,4%，5）50 L，按.0 Ug壳聚糖酶底比加入粗酶液,37反应 h后,煮沸灭活,测 定各反应液释放的还原糖的量。(3）最适H的确定 按3。22方法配制浓度为3%,一系列不同pH的壳聚糖胶状液(36，

38、44，,2,5)50 mL，按60U儋壳聚糖酶底比加入粗酶液，3反应4 后,煮沸灭活,测定各反应液释放的还原糖的量.(4)最适温度的确定将50 11L3,pH 5.6壳聚糖溶液按6.0 U儋壳聚糖酶底比加入粗酶液，不同温度(，4，5，65,75,85）下保温反应4 h后，测定各反应液还原糖含量。（)酶解最适加酶量的确定将50 mL 壳聚糖溶液（pH .6)与不同量的壳聚糖酶液(1，2，4，5，6，7,8,9，1 U儋 壳聚糖）混合,65保温反应4 h后，测定各反应液还原糖含量.（6）不同脱乙酰度壳聚糖底物对酶解的影响 将三种不同脱乙酰度壳聚糖(75%,85，2）按23.22方法配制浓度为3，

39、56的底物溶液，以Ug壳聚糖加酶量，5反应4 后，测定各反应液还原 糖含量。一3.酶解产物的分析检测2。33。酶解不同时间的产物的TC分析制备一系列3壳聚糖底物，按照2。32优化后的最适酶解反应条件进行水解,取酶解 ， h,6 h，1 h，24 h的水解液，以混合标品作对照,进行T分析。14壳寡糖的酶法制各分析及其初步分离。3.2壳聚糖平均聚合度随水解时间的变化向壳聚糖底物中,按 U儋壳聚糖加酶量加入适量酶液。在65,H6 下进行水解，定时进行取样(O Illi,lOmin，20“n，3 lIin，l ，3 h,6 h，12 h, 24 h）,测不同时间下水解产物的平均聚合度。333壳聚糖酶解

40、样品的红外光谱分析采用iole NexuS 470傅立叶变换(原位）红外光谱仪对样品进行红外分析。2 ln冷冻干燥的壳聚糖酶解样品与200 mg KBr充分研磨混匀压片。在400 cm1到4000cm-1范围内，对样品进行扫描.2.3。34酶解产物的HPC分析。色谱柱：依利特hyperS N2 P。0柱（4。6250 m），流动相:乙腈:水=75：25;流速为mn，检测器为示差折光检测器，柱温30，进样量0此检测样品为混合标品(单糖六糖）和酶解24 样品。33.乙酰丙酮法测定壳寡糖的数均分子量 壳寡糖有广泛的实际应用，并且其功能用途与其分子量紧密相关。本文通过选择不同的加酶量和酶解时间，以期望

41、得到各种不同分子量的壳寡糖。2。3。4低聚壳聚糖的初步提取分离及分析2.3.4.1初步提取分离 关于低聚壳聚糖的提取方法有很多，例如有机溶剂沉淀、凝胶渗透色谱、超滤膜过滤等。本论文采用有机溶剂沉淀的方法从酶解液中提取低聚糖，并分析其成分。按照优化后的酶解条件，酶解底物4 h.水解结束后，用乙醇分级沉淀的方法 从酶解液中分离得到不同分子量的低聚糖,得到75%醇析沉淀(75)、87.5醇析 沉淀(P7）、5醇析上清(ES87）。具体提取流程如下图。5华叶I农业大学ll届硕士研究生学位论文图2。2低聚壳聚糖的提取流程Fig2Exntion 阳c鹤s ofchitoa oligoaccaride234

42、2提取物的薄层层析 将提取到的5、E8和ES87分别溶于水中，按前面介绍的薄层层析方法进行展层显色。234.提取物平均聚合度以及数均分子量的测定 按照前面介绍的端基法、乙酰丙酮法分别对EP和EP8进行平均聚合度和数均分子量的测定。16壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离3结果与分析531产壳聚糖酶菌株膨括掰缈砌sp。4发酵产酶两步法的探索31。1氨基葡萄糖标准曲线及壳聚糖酶活力计算公式.35 3 n25O.2.。15.I o0OOO。5l522。533445氨基葡萄糖（1)图31氨基葡萄糖的标准曲线i。一l Stadad e of amiogucs壳聚糖酶活力的计算公式为:(OD样品一OD空白)8

43、稀释倍数/(O。079反应时间)。312在壳聚糖培养的条件下该菌的生长曲线和产酶曲线的测定3 8.5o昌，喜霹 8垂i凹一旦 go删 萄7。5雾删2鬃吞肇髓7l 565l41284064788100时间Ti眦图32生长曲线和产酶曲线i- The cr昭ofctei gm叭h a 巧mepduction17华【1农业大学20ll届硕士研究生学位论文上图是壳聚糖培养基条件下的菌株施8螂胁p。41.2的生长曲线及产酶曲线。从生物量的变化可知，发酵进行到12 h时开始结束对数期,而进入稳定期。壳聚糖 酶的合成基本上与菌体生长同步，表现出产物生成与菌体生长呈部分相关型.壳聚 糖酶的合成速率在对数生长期逐

44、步加快。而当菌体生长进入稳定期后，壳聚糖酶的 合成速率开始减慢。发酵过程中检测酶活为3.U/左右。313菌体生长和诱导产酶两步法可行性探究实验4453，”52鲁色m器u。n l 帖5O。22.5335445时间/d图3两步法发酵产酶曲线Fi33Pmductnof chitosaase b tw-tepeentai本实验旨在探索两步法提高酶活的可行性，结果如图33,实验组在富集菌体转接入壳聚糖培养基后经过短暂的适应阶段后,在对数期至稳定期阶段大量产酶, 3。 d趋于稳定。对照组因为没有壳聚糖诱导物,整个发酵阶段都不产酶，充分说明 该酶是诱导酶.并且最终酶活能达到4 /mI，左右,对比于壳聚糖培养

45、条件下的酶活3.5U/IIlL有了一定程度的提高。可得出，该菌可以适应碳源从葡萄糖到壳聚糖 的转变，即菌体富集和诱导产酶两步法是可行的,且菌浓度提高后酶活也相应提高.故可以通过菌体富集和诱导条件两个方面的优化来最终提高酶活。314菌体富集发酵条件的优化3.1。4。1不同碳源对生物量的影响8壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离05 4 3.。.0 2O ，0 蔗糖淀粉玉米淀粉红薯淀粉壳聚糖不同碳源图34不同碳源对生物量的影响Fg.34E躬fecto dif.e他crbn ms on ioma碳源是微生物生长培养基组成的重要成分之一,选择最适宜菌体生长的碳源很 重要，结果见图34。菌株对以上碳源均可以

46、利用，壳聚糖作碳源菌浓度氏o为0。33，其中葡萄糖作为速效碳源可使菌体在短时间内富集,故选定较佳碳源为葡萄糖。1.42碳源浓度对生物量的影响（J5（) .48(）4。 O44 毫(）.4225肉妣 内凶姗O.O上幽慨刨姒38葡萄糖浓度图35碳源浓度对生物量的影响i.35 Ihct of lucose concetraonon biomss9华t农大学20l橱硕士研究生学位论文将选定的碳源酉己制成一系列浓度梯度的溶液，选取最适合荫体牛长的浓度，结果如图35,生物量随葡萄糖浓度的升高而增长,但当超过2.5%时，反而对菌体的生长起到了抑制作用，故选取25为最适浓度.314。不同氮源对生物量的影响08

47、.7 ()60.。主oO。3 0 21自（J。(J个肉骨蛋j脲腴货胍孵叼粉眯系洲4（ 不同氮源图.6不同氮源对生物量的影响ig36ffct odiffellent nimgensources on omass从常见氮源中选取最适宜菌体生长的，结果如图6，菌体对有机氮的利用远远好于无机氮，有机氮中又以蛋白胨的利用效果最好，故选用蛋白胨为较佳氮源.3.44氮源浓度对生物量的影响0。80.7060。5主o4030。20.10.O。5嗍 门慨白由口01氮源浓度图.7氮源浓度对生物量的影响ig.37Effct opeptone oncetI翟“o onoass0壳寡糖的酶法制各分析及其初步分离将选定的氮

48、源配制成一系列浓度梯度的溶液,选取最适合菌体生长的浓度，结果如图37,当蛋白胨浓度为0。9%时，菌浓度A60达到了0.5，而随着浓度的升高，氏oo却有了下降的趋势,故选定较适浓度为314。5p对生物量的影响口 图38pH对生物量的影响Fig。38E仃le fpH io将优化后的培养基调节pH,分别配制成从5到9的不同pH的培养基，结果如图3所示,该菌适合在偏中性条件下生长,在pH 67的条件都能较好的生长，在 pH6。5处达到最大值，故选取较佳H为.5314.装液量对生物量的影响I冈口1l 5（）8（)o230装液量（mL/100mL)图9装液量对生物量的影响Fg.3Effct of uid

49、volume n biass华中农业大学20l届硕士研究生学位论文通过以上条件的优化，菌体富集的同时对溶氧也有了一定的要求，对不同装液 量对菌体生长进行了研究，由图39所示，装液量多于0 mL时，不利于菌体的 生长。故选取较佳装液量为180 L,此时菌浓度A枷达到了1经过上述各条件的优化,菌浓度己由最初的033增长到了1.0，提高了两倍多，菌体富集阶段的优化有了显著成效,为下一步的诱导阶段奠定了基础。1.诱导条件的优化315。1不同诱导物对产酶的影响545+壳聚糖胶体3 5+壳聚耕粉末吕1氨基葡萄糖=、3、一,2 !髓2l5 lOO02时间d图。lO不同诱导物对产酶的影响Fg3-0 EfIle

50、ct fdiffbet nuce on e e珂e roducti选取三种不同诱导物,在生长过程中对壳聚糖酶的酶活进行测定，结果如图 310，该3种诱导物对壳聚糖酶的产生都有一定的诱导作用,壳聚糖粉末因为没有 经过酸的溶解阶段，故大部分不能被菌株利用;氨基葡萄糖作为聚合物的单体结构， 也有一定程度的诱导作用。其中以%壳聚糖胶体的诱导效果最佳.壳寡糖的酶法制备分析及其初步分离31.5.2诱导物浓度对产酶的影响.葛三！!g 溢3天数图。1诱导物浓度对产酶的影响Fig3一llEffect of chisa cctraion n th IIme prduction对选取的诱导物进行浓度梯度实验,确定最

51、佳的诱导条件以及诱导时间，结果如图3.1，以15%壳聚糖胶体作为诱导物时，发酵过程所产酶活最高。浓度过低， 达不到最好的诱导效果;浓度过高，由于壳聚糖的粘度和其高分子量，对菌体产酶 有了一定的抑制作用。故较佳的诱导条件为1。5壳聚糖胶体诱导3 d.2壳聚糖酶解条件的优化32酶解时间的确定0口星 8号嘲 糖避 4发2O00l1502253504时间I血图12反应时间对酶促反应的影响ig3一12 Efct fnationtilnon em叮ati心actio华r z农、k大学20IJ苗硕士研究生学位论义对酶解条件的优化首先是酶解时间的确定,如图。12，随反应时问的延长，酶 解产物的还原糖逐步增加。

52、在反应的前4 h内，随时间延长，还原糖的量以较快速 度增加.4h后还原糖的量趋于稳定，可能由于产物抑制或酶部分失活变性等因素 的影响，酶反应速度直接降低（王丽娟等，004).因此,初步确定最适酶解时间为4 。3.2.最适底物浓度的确定64一。L【j辎器臣爿n妣度 口日U一nU450门U揽壳聚 糖 浓图3.13底物浓度对酶促反应的影响Fg。一13 E丘.ec f he onttio of chtsa on en巧matirectio底物浓度是影响酶促反应速度的一个重要因素,对不同浓度的底物进行酶解实 验，如图313,随着壳聚糖浓度的增加,还原糖的释放量也显著增加,在浓度为 3时达到最大值。而4%

53、和%浓度的还原糖释放量却大幅降低，分析可能有两个原因，一是因为高浓度底物对酶解有抑制作用，二是高浓度的壳聚糖胶体粘度太大， 抑制了酶解反应的进行。故选择3的壳聚糖底物进行酶解实验。3.23最适H的确定24壳寡糖的酶法制各分析及其初步分离门弘 门U伽门H犏 门弛 H图314 对酶促反应的影响Fi昏314Efof pHone珊秒tic代cton壳聚糖在5.6以上会出现沉淀，pH3。6以下酸解作用太强,影响酶解实验的 结果,故选择此范围内考察pH对酶解的影响。如图314，pH在65.之间，还 原糖的释放量随pH逐步上升而增大；pH在5。2。之间，还原糖的释放量基本 没有明显变化。可得出，酶解反应的最

54、适p为一个范围，即.5.3。24最适酶解温度的确定6208门巧 门川U钙由西5（0二11撂器墨吲I川巧温度 ( 4由20图31温度对酶促反应的影响F。-15 仃酏t empemtlnnem可ma actin华t Jt农、fp大学20I朋硕士研究生学位论文酶对温度具有高度敏感性。如图3.15,565范围内，随着温度升高,还原 糖的释放量逐步增加,到5时达到最大值。温度继续升高，还原糖量反而急剧下降,接近为零,说明温度高于时，因为高温,酶基本丧失活性.3.2酶解最适加酶量的确定蒿由 H 内U南 467891（)加酶量（g壳聚糖）图6酶浓度对酶促反应的影响Fig.316Ect f e秒me o皿cena60oeytceact