一些固定液及方法介绍

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1、一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简 要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。1.4%多聚甲醛-O.lmol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（PhosphateBuffer以下简称PB），加热至60C左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许 1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免

2、疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定224h。另外， 该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB 液：Na2HPO42H2O16.88g蒸馏水300mlC 液: NaOH3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注 意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中， 混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl将pH调至7.27.4,最后，补充蒸馏水至1000ml充分混 合，4

3、C冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使 其终浓度为0.5%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4C冰箱 保存数月仍可获得满意的染色效果。3. Bouins 液及改良 Bouins 液试剂：饱和苦味酸40% 甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4C冰箱中 备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouins液即不加冰醋酸。该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏 酸（pH为33.5），对抗原有

4、一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外， 操作时，应避免吸入或与皮肤接触。4. Zambonis（Stefaninis）液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlKarasso n-Schwlts PB至 1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml,加热至60C左右，持续搅拌使充分溶解、过 滤、冷却后，加Karasson-Schwlts PB至1000ml充分混合（Karasson -Schwlts磷酸缓冲液的配制配 制方法见后）。该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究， 为实验室常用固定剂之一。我们

5、在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为618h。5. PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液(Periodate-Lysine-paraform-aldehyde fixative)试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐(或盐酸赖氨酸)：多聚甲醛蒸馏水配制方法：(1) 贮存液A (O.lmol/L赖氨酸-0.5mol/L Na3PO4,pH7.4)：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸 馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4,补足 0.1mo

6、l/L的PB至100ml,使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4C冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗 透浓度为300 mOs mmol/L/kg。(2) 贮存液B (8%多聚甲醛溶液)：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液(方 法见前)。过滤后4 C冰箱保存。(3) 临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠(NaIO4),使NaIO4终浓度为2%。 由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为618h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸 氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的

7、双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原 绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固 定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是： 含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。6. Karnovskys 液(pH7.3)试剂：多聚甲醛 30g25% 戊二醛80ml0.1mol/L PB至 1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混 匀。

8、该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4C短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定 能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定1030mi n,用缓冲 液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。7. 0.4% 对苯醌(Parabenzoquinone)试剂：对苯醌4.0g0. 01mol/L PBS 1 000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。 一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色

9、，会使组织 标本背景增加，影响观察。此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。8. PFG 液 (Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG)试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25% 戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二 甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多 种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。9碳二亚酰胺-

10、戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS500mlTris约 14g浓HCl少许ECD10g25% 戊二醛3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris （使其终浓度为1.4%）溶解，以浓 HCl调pH至7.0,再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2 3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细 胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23C固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。ECD 即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐

11、酸盐1-ethyl-3（3-dimethyl-aminoprpyl）-carboi imide hydrochloride，简称乙基-CDI,常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD 单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透， 利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研 究的很好的固定剂。10.四氧化锇（锇酸 Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用 钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好

12、瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。为保证 充分溶解，应在用前几天配制。（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。（2）1% OSO4-PB：试剂：A、2.26%NaH2PO4 2H2O4.15mlB、2.52% NaOH 8.5mlC、 5.4%葡萄糖5mlD、 OsO40.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.37.4,取AB混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。（3）1% OsO4/0.1mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH7.27.4）：试剂：2%

13、 OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.27.4） 10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。 OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白 质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适 于电镜研究。但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前 常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液

14、。关于固定液种类还很多，如70%90%的酒精、 丙酮、醋酸酒精（含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们 最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之， 掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。 目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4 C的Karnovskys液灌注固定1030min后，接 着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zambonis液等混合固定液。