乳酸菌数量测定

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1、酸菌数量测定I三|=|1、目的通过试验，测定乳酸菌的含量，看乳酸菌的是否符合工厂出厂标准（1.5X108）。2、试验材料2.1、菌种：发酵罐、待出货样品2.2、试剂配置生理盐水：陈总办公室饮水机温水500ml+ 4.5gNaCl （实验室的电子天平的精确度为0.01g，所以称 4.50g、4.51g 都行）225ml生理盐水：用250mL的量筒量取225mL生理盐水稀释用的生理盐水：2个样品X7个稀释度=14根试管，用10mL的移液管移取9mL生理盐水MRS培养基：2个样品X3个稀释度X2个平行X15ml培养基=180ml培养基200ml培养基；陈总 办公室饮水机温水200ml+12.86gM

2、RS培养基（由于琼脂的凝固效果不太好，所以要多加培养基，培 养基的量为13.40g - 13.60g）2.3 实验器材：培养皿：2个样品X3个稀释度X2个平行=12个对扣培养皿“L”型涂布棒：2个样品X3个稀释度=6根“L”型涂布棒10mL移液管：2个样品=两根移液管3个500mL的三角瓶、1000uL枪头一盒、100uL的枪头一盒、移液枪、2个饭盒、两个蜡烛、 两个瓶盖、两个易拉罐罩子、75%酒精棉、试管架、“L”型涂布棒3、实验步骤1、计算实验要用的基本培养基、培养基。2、配试剂，NaCl可以用白纸来称，MRS培养基直接用三角瓶来称，调MRS培养基至6.20.053、 用报纸把实验器材（3

3、个500mL的三角瓶、1000uL枪头一盒、100uL的枪头一盒、10mL的移 液管、20个对扣培养皿、2组的7根试管、“L”型涂布棒）包好，然后灭菌（121C、20min），这个 过程大概花费1h1.5h左右。4、当高压蒸汽灭菌锅鸣声，显示“END”的时候，把高压蒸汽灭菌锅的电源开关关了，然后打开单 人无菌操作台的紫外灯对单人无菌操作台进行杀菌消毒，然后把门依次关好，然后到实验室把无菌 室的紫外灯打开，对无菌室进彳丁杀菌消毒。紫外杀菌过程一定要30min以上。5、当高压蒸汽灭菌锅的压力指数为“0”时，然后打开高压蒸汽灭菌锅，用毛巾把里面的篮子提出 来，把里面的东西捡出来，把东西均匀的分开，一

4、遍冷却。对于2个225mL的生理盐水、200mL的 MRS培养基，可以放到水里进行冷却，放在水里大概15min左右。6、用100mL的三角瓶取样品，然后测定PH、和温度。7、冷却好了，把东西（灭菌篮（3个500mL的三角瓶、lOOOuL枪头一盒、100uL的枪头一盒、10mL 的移液管、20个对扣培养皿、2组的7根试管、“L”型涂布棒）、待测样品、1000mL大烧杯）放到 传送窗里，然后人从无菌室的门进去，在第一个无菌室进行换鞋换衣，然后把传送窗的东西捡到推 车上。8、对手、无菌操作台进行酒精消毒，然后点燃酒精灯。把一大包培养皿拿到无菌操作台里面，拆开 培养皿，如果培养皿里面有水，可以甩干，表

5、面有水可以在报纸上搽干。把试管倾斜拿进无菌操作 台里面，拆开报纸，按编号把试管放入试管架里面。把大烧杯拿进无菌操作台里面。熄灭酒精灯， 打开排风机，把里面的热气排干静，然后关闭排风机。9、打开酒精灯，把 MRS 培养基拿进无菌操作台里面，拆开报纸，拔开瓶塞丢到大烧杯里面。倒培 养基，瓶口一直放在火焰上面，培养皿开口也一定要放在火焰上面，每一个培养基尽可能的均匀， 而且平板必须放平，防止平板倾斜，一边厚一边薄，尽可能的做到均匀点，倒完培养基，清理操作 台。如果平板过热，可以把平板拿到手推车上面冷却，但是注意大的培养皿一定要盖住小的培养皿， 防止空气中的细菌掉落到小培养皿的 MRS 培养基上面。熄

6、灭酒精灯，打开排风机，把三角瓶拿到手 推车上面，等气体变冷，关闭排风机。9、稀释：点燃酒精灯，把大的枪头的报纸拆开，把样品、225mL的稀释液拿进无菌操作台，拆开报 纸，橡皮筋丢进大烧杯里面，报纸先放在里面，拔开瓶塞，用10mL的移液管移取25mL样品于225mL 的生理盐水中，然后塞紧瓶塞，把移液管放入大烧杯里面，倾斜着拿出三角瓶，用手摇匀，把漩涡 中心摇到瓶底，大概要23min左右，然后倾斜的在拿进无菌操作台里面。拔出瓶塞，用1000uL移 液枪吸取1mL菌液，再塞上瓶塞，然后把菌液放入10-1的试管中，用摇匀机摇匀试管中的菌液；再 拔出10-1试管塞，用1000uL移液枪吸取1mL菌液，

7、再塞上试管塞，把菌液放入10-2的试管中，用 摇匀机摇匀试管中的菌液；如此，直到摇匀机把10-6 试管摇匀好。用报纸把无菌操作台面搽干净， 然后再西施另一个样品。做完以后，盖灭酒精灯，打开排风机，拿出三角瓶、样品，等气体变冷后 关闭排风机。10、接种：点燃酒精灯，把培养皿按序号依次放好，拆开500uL的枪头（防止散架），用100uL的 移液枪，插进枪头转两圈，然后拿出移液枪，将10-5试管倾斜放置，用枪头吸取0.1mL的菌液，放 入培养皿中心，再用此 100uL 的移液枪，放入平行培养皿中心，换另一个枪头插进枪头转两圈，然后拿出移液枪，将IO-6试管倾斜放置，用枪头吸取O.lmL的菌液，放入培

8、养皿中，再用此lOOuL的 移液枪，放入平行培养皿中心，换另一个枪头插进枪头转两圈，然后拿出移液枪，将10-6试管倾斜 放置，用枪头吸取O.lmL的菌液，放入培养皿中，再用此lOOuL的移液枪，放入平行培养皿中心。 把“L”型涂布棒上的橡皮筋搓下来，拆“L”型涂布棒的报纸，注意不需要全部拆下来，一定让 “L”型涂布棒放在报纸里面，上面也要盖着报纸，从报纸里面拿出“L”型涂布棒，然后手拿培养 皿开口在火焰上面，用“L”型涂布棒把菌液均匀铺开，然后用此“L”型涂布棒涂布另一个平行培 养皿，然后把此“L”型涂布棒放入大烧杯里面，换另一跟“L”型涂布棒依此操作，直到全部涂布 均匀。盖灭酒精灯，打开排风

9、机，把试管放入大烧杯，然后关闭排风机。11、清理：将东西清理好，报纸、移液管、三角瓶、“L”型涂布棒都放入灭菌篮里，然后放入传送 窗里，人换衣换鞋出来，把东西拿出来，把东西整理好，报纸丢进蛇皮袋里，酒精棉丢进垃圾篓里 其他的放入灭菌篮里。12、入盒：把2组的饭盒、易拉罐罩子、蜡烛、瓶盖、餐巾纸、75%的酒精放入传送窗里，然后人 换衣换鞋进去，用卫生纸蘸 75%的酒精对饭盒、易拉罐罩子、瓶盖、进行灭菌消毒，灭菌消毒后把 东西放入无菌操作台。把样品分为两组放入饭盒，点燃蜡烛，用易拉罐罩子罩住，用饭盒盖住进行 密封，等蜡烛熄灭，把饭盒、75%的酒精、垃圾放入传送窗，人换鞋换衣出来，把饭盒放如37C的

10、 恒温培养箱中培养。13、打扫：把实验器材洗干净，用拖把把无菌室、实验室拖干净。14、计数：培养 48h 后，对培养皿进行计数。4、实验数据记录样品名称样品数量样品PH样品状态和特性接样日期检测日期检测项目乳酸菌检验依据GB/T 4789.35 2003使用仪器恒温培养箱：C 31752752C3164 2584C3191-3083C3107-1563名称及编 号超净工作台：B 42563958 B 42573959 B 42583960 压力蒸汽灭菌锅：B 42593961 生化培养箱：C3173-2690光学显微镜：A 1089 2557酸度计：B 2149 2676电子天平： B 108

11、12495测试方法(1)取25 mL样品加入225mL无菌生理盐水中，混匀制成10-1的稀释液，依此类推制成10-210- 的稀释液；(2)吸取10-10- 稀释液各1mL注入无菌平皿中，每个稀释度做2个 平行；(3)倾注已融化并冷却至45C左右的改良MC琼脂培养基(配制日期：9月7 日)于以上平皿中，待凝固后，倒置于361C培养72h,随机挑取5个菌落 做初步验证试验，并计数。稀释度样品名称10-510-610-7平均值 cfu/mL(g)平板菌落形 态乳酸菌总数 cfu/mL总结乳酸菌数量测定过程中会造成污染的原因有：1、 培养基本身有霉菌，实验室试剂用水，在高温灭菌锅内形成了芽孢，没有彻底灭菌。2、实验器材在高温灭菌锅内没有彻底灭菌。3、实验器材和试剂在空气中冷却过程中，空气中的杂菌落在上面。4、无菌操作台上的细菌没有被紫外线彻底杀菌完成5、样品中也有杂菌6、在接种涂布过程中，要先用 75%的酒精对手进行搽洗，把手上的细菌消除7、包裹的器材的报纸一律在操作台里面进行分拆8、操作台操作时，尽可能的点燃酒精灯，因为酒精灯灭菌最彻底9、在接种、涂布过程中，大的培养皿一定要罩着小的培养皿，防止空气中的杂菌掉落 到MRS培养基里面10、培养过程中，把培养皿放入饭盒前一定要对饭盒进行酒精消毒，杀死杂菌。