产淀粉酶菌种的分离

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1、产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化一设计背景 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价 值的重要酶类。是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。所以 开始产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化。二目的要求分离筛选出产淀粉酶菌种，并进行鉴定和产酶条件的优化三实验技术步骤及详细流程 采集含菌样品 设计配制选择性培养基 分装灭菌 平板涂布分离 纯化菌种（透明圈法） 划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法） 液体培 养法复筛产酶菌种，检测产酶性能 目的菌种斜面和甘油保藏 目的菌种的 染色法显微观察 目的菌种的常规生理生化鉴定 考

2、察紫外线对产酶菌种生 长及产酶性能的诱变效应 考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能 的影响 考察PH对产酶菌种生长及产酶性能的影响1. 采集含菌样品 根据所选产酶菌种的要求，我们宜在淀粉制品霉变的样品中分离。故在新校区的花坛中提前一周埋入淀粉制品（距离地表5cm左右），一周后用小铁勺在新校区的花坛中挖出泥 土，放入提前准备好的塑料袋中。2. 培养基的配制2.1 平板筛选培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%， NaCl 0.5%,可溶性淀粉20，琼 脂 1. 52. 0%, pH 自然。121C灭菌 20min。2.2 摇瓶复筛培养基：玉米粉3 ，玉米浆3 ， CaCl2013 ，

3、 Na2HP04 03，（NH4）2S04 0. 4%, pH 6. 0。121C灭菌 20min。2.3斜面保存培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaCI5.0g，琼脂15.020.0g，加蒸 馏水至 1000ml。 pH7.07.2。2.4种子培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCI5.0g，琼脂15.020.0g，加蒸馏水 至 1000mI。 pH7.07.2。25 产酶液体培养基:玉米粉3%，玉米浆3%，CaCI20.13%， Na2HP04 0.3%, （NH4）2S04 0. 4%，pH 6. 0。121C灭菌 20min。3. 分装灭菌 将所需要灭菌的仪器，如

4、培养皿，锥形瓶，试管，移液管灭菌，使用加压蒸汽灭菌法。一般 使温度升高到 121 摄氏度，高温加压 20Mmin。4. 平板涂布分离纯化菌种（透明圈法）称取土壤样品1g溶于9mL无菌水中，将水样品5mL溶于45mL无菌水中，分别用无 菌水梯度稀释至1X107倍，取1X105、1X106、1X 107稀释液涂布于平板筛选培养基表面。37摄氏度培养72h，用无菌的牙签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。 影印过的培养皿37C培养72h,取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。根据记录 从剩余2皿中挑取对应有透明圈的单菌落，转接，经平板划线法得到纯种。接种斜面保存培 养基中，培养后

5、于4C保藏。5. 划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法）将初筛得到的菌种涂布于平板筛选培养基表面。依然37摄氏度培养72h,用无菌的牙 签挑选单菌落影印2-3皿，同时用签字笔对各单菌落标号。影印过的培养皿37C培养72h, 取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。挑取有透明圈的单菌落，转接，经平板划线 法得到纯种。通过复筛，划线分离进一步纯化产酶菌种，接种斜面保存培养基中，培养后， 于4C冰箱保藏。6. 液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能6.1复筛得到的纯菌种接种于30 / 250mL种子培养基，37摄氏度、250r/min摇床培 养过夜。种子液以2%接种量接种于产酶液体培养基50/ 50

6、0mL，相同条件培养72h，发 酵液8 000r / min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果取平均值。6.2 酶活测定方法测定方法：3， 5 一二硝基水杨酸比色法。1.标准梯度糖液配制，分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 于16号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。2.还原糖液的提取，精确称取样品1.0g于100ml 小烧杯中，再加入50ml蒸馏水搅匀，用水定容到100ml。3.过滤，取滤液1ml于7、8号试 管中，待用。4.称取样品1.0g，放入100ml小烧杯中。加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml 蒸馏水，沸

7、水浴加热25min.用胶头滴管滴23滴碘化钾一碘溶液于培养皿中（可以稍微稀 释），用细玻璃棒 蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全， 否则继续沸水浴加热并每隔 5min 以相同的方法再次测定，直至完全水解。 5.取出完全水解 的样品，冷却后滴加23滴酚酞，用6mol/L NaOH滴定至中性。6.用水定容到100ml，过滤， 取5ml滤液，再次定容到100ml。7.取6中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。1.OD540的测量及标准曲线的制作，在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只 试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，

8、再流水冷却。2、每支试管加 入再 4.0ml 蒸馏水并摇匀。 3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其 OD540,以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。4、取16号试管中的数据， 做出OD540还原糖含量曲线，纵坐标为OD540，横坐 标为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5， 单位mg。5、在曲线上读出710号试管的含量值。1.计算.取7， 8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9， 10号试管含量的平均值 作为总糖的含量值。2.还原糖含量%=还原糖毫克数X样品稀释倍数（100）样品毫克数 （1000 ） X100%总糖含量=水解后还原糖毫克数X样品稀释倍数

9、（2000）X0.9 样品毫克数（1000 ） X100%酶活力定义：在 40 摄氏度、 pH 60， 1min 从可溶性淀粉中释放 出 lumol 还原糖所需 的酶量。7. 目的菌种 将筛选出的菌种接种到我们的斜面培养基或者用甘油保存。斜面保存培养基:牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g, NaCI5.0g,琼脂15.020.0g,加蒸馏水至1000ml。 pH7.0 7.2。菌种甘油保存方法：1.将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期(肉眼见培养 体系内浑浊即可), 2 .将甘油稀释至浓度为 50%(等体积蒸馏水加等体积甘油,甘油需要 慢慢吸)，3 .将甘油、2 ml离心管、枪头等试验用品

10、于121 灭菌20min , 4 .无菌条件下 将菌液与50%浓度甘油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25%,5 .于-20C冰箱内保存。8. 目的菌种的染色法显微观察( 1)取目的菌种进行涂片、干燥、固定。涂片不宜过厚。(2) 初染，滴加结晶紫以刚覆盖为宜，染色12min,水洗。(3) 媒染，用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,水洗。(4) 脱色，用滤纸吸去残水，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即 水洗。脱色时间一般约 2030s。(5) 复染，用0.5%番红溶液复染约2min,水洗。革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则 呈现红色。( 6 )镜检，用油镜观察。

11、9. 目的菌种的常规生理生化鉴定9.1 糖发酵实验(1) 取四支倒置了徳汉氏小管的试管，向其中分别加入无菌乳糖培养基、无菌葡萄糖培养 基、无菌蔗糖培养基、无菌麦芽糖培养基。(2) 用记号笔在各试管外壁上分别做标记，以区分各培养基，并在培养基中加入指示剂(溴 甲酚紫)。(3) 在四支试管中接种目的菌种，将接种后的试管放置于37C的温箱中培养24h48h。(4) 观察各试管中颜色变化以及徳汉氏小管中有无气泡。9.2甲基红试验(MR试验)(1) 菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37C培养48-72h。(2) 配置甲基红试剂(甲基红0.02g, 95%酒精60mL，蒸馏水40mL), 20mg甲基

12、红溶于60 mL95%乙醇中，然后加入40mL蒸馏水。(3) 取出后加甲基红试剂3-5滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳性，橙色者为 可疑，黄色者为阴性。9.3 接触酶试验取洁净载玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%屯021滴，立即观察结果。9.4 硫化氢产生试验(1) 取SIM培养基(胰胨20g、多价胨6g、硫酸铁铵2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂3.5g) 30g,加热溶解1000ml蒸馏水中，分装试管，121C高压灭菌15分钟备用。(2) 将目的菌种穿刺接种至培养基中。将所有试管置于37C下培养24-48小时。(3) 检视所有SIM培养基，观察接种线有无黑色产生，将记录结果，判断目的菌

13、是否具有 产生硫化氢之能力。再观察微生物是否沿接种线向四周扩散，并判断其是否具运动性。10. 紫外线对特定产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应(1) 菌种活化将目的菌接种到固体斜面培养基上，放入培养箱中于37C培养24h,即得活 化菌株。(2) 菌悬液制备取活化后的菌种2环接种于盛有100ml无菌水的三角瓶中,加入无菌玻璃 珠，并置摇床上振荡20min,配成106-108个/mL的菌悬液。(3) 紫外线诱变及筛选各取5mL菌悬液移入18个无菌培养皿中，置于距30W紫外灯30cm 处的磁力搅拌器上照射1min,然后打开皿盖并开启磁力搅拌器，分别照射0s(对照用)、50s、 60s、70s、80s、9

14、0s、100s、110s、120s(各做2组)。在暗光条件下，分别取经紫外线诱 变的菌悬液0.1mL涂布于18个固体鉴别培养基上，倒置于37C恒温培养箱中避光培养36h， 计算致死率。喷洒碘液后，挑选单菌落变色圈直径与菌落直径比值H /C22. 0的菌株，进 行摇瓶发酵实验，测定其产酶能力。11. 碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响11.1 最佳碳源的确定在500mL三角瓶中各装50 mL基础发酵培养基，其中的碳源分别为可溶性淀粉、玉米粉、葡 萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖；设3个重复。接入种子液2mL，37C，180r/min培养4d,测 定粗酶液酶活。11.2 最佳氮源的确定在5

15、00mL三角瓶中各装50 mL基础发酵培养基，氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米 浆、大豆粉、硫酸铵、蛋白胨10 g/L+酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L+蛋白胨5 g/L；设3 个重复，接入种子液2 mL, 37C, 180r/min培养4d,测定粗酶液酶活。12. pH 值对产酶菌种生长及产酶性能的影响在500ml的三角瓶内装基础培养基50 mL，加缓冲液调节至不同的pH值(4、5、6、7、8、 9),灭菌冷却后接种子液0.5mL, 37C恒温培养4d,取样测定产酶菌的生长状况和淀粉酶酶 活。四实验所需仪器设备和耗材水平摇床，电热恒温水浴锅，压力蒸汽灭菌器，台式离心机， 754 紫外可见分光光度计， PH 计，电子精密天平，高速离心机，烘箱，培养箱，玻片及盖玻片，接种环，光学显微镜， 培养皿，牙签，离心管，枪头，移液枪，锥形瓶，试管铁勺，小塑料袋，试管，三角瓶，徳 汉氏小管，磁力搅拌器，紫外灯牛肉膏，蛋白胨，NaCI,葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，可溶性淀粉，琼脂，玉米粉, 玉米浆，酵母粉，大豆粉，CaCI2, Na2HP04, (NH4)2S04,蒸馏水，甘油，结晶紫，碘液， 95%的乙醇，番红溶液，甲基红，溴甲酚紫，H2O2，胰胨，多价胨，硫酸铁铵，硫代硫酸钠, pH 缓冲液。