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1、第二十一章第二十一章分子杂交特性（见第二章）分子杂交特性（见第二章）探针技术探针技术印迹技术印迹技术p核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)p利用利用DNA变性与复性这一基本性质来进行变性与复性这一基本性质来进行DNA或或RNA定性或定量分析的一种技术。定性或定量分析的一种技术。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理一种可以将目的微量的一种可以将目的微量的DNA片断扩增片断扩增100万倍以上的技术万倍以上的技术(末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影侏罗纪公园，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有)PC
2、R 可以把 数量放大百万倍百万倍染色体Mullis(1993)一、基本工作原理一、基本工作原理（一）（一）PCR体系基本组成成分体系基本组成成分l含含Mg2+的缓冲液的缓冲液ldNTPsl耐热耐热DNA聚合酶聚合酶lTag DNA聚合酶聚合酶l特异性引物特异性引物l一对分别与待扩增一对分别与待扩增DNA序列两端互序列两端互补的寡核苷酸片段。补的寡核苷酸片段。l模板模板DNA（二）（二）PCR基本反应步骤基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C循环循环2530次次使模板使模板DNA完全变性成单链。完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以
3、消除的局部双链得以消除使引物和模板使引物和模板DNA退火结合退火结合此温度下此温度下DNA聚合酶以聚合酶以dNTP 为底物催化为底物催化DNA链的延长链的延长三个步骤为一个循环，三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环轮模板进入下一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物引物A引物引物B变性（变性（95）6075859590807065555045403530退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/3/3/5/5/5/引物引物A引物引物B6075859590807065555045403530变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72
4、）5/5/5/5/DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol5/5/5/5/5/5/5/60758595908070655550454035305/变性（变性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因组基因组DNADNA样品样品第一次循环第一次循环第二次循环第二次循环第三次循环第三次循环第四次循环第四次循环待扩增序列待扩增序列引物引物A引物引物B3/5/3/5/5/3/5/3/四、四、PCR的主要用途的主要用途PCR的的用途用途基因突变基因突变分析分析基因的基因的
5、体外突变体外突变目的基因目的基因的克隆的克隆DNA序列测定序列测定DNA和和RNA的微量分析的微量分析1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。
6、核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理 化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(sanger法法)一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)基本原理基本原理 基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNA链在链在1个或个或2个碱个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的不同的DNA片段，将这些片段经
7、电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNA的的5 末端，经放射末端，经放射自显影即可在自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNA链的序列。链的序列。二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法 2，3-双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）无无3碳原子上的羟基，故不能与下位核苷酸碳原子上的羟基，故不能与下位核苷酸形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。DNA合成反应在此终止。合成反应在此终止。2，3-双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP）AGCTDNA-PoldNTPsDNA-PoldNTPsDNA-PoldNTPsDNA-PoldNTPs53引物引物待测
8、序模板待测序模板DNA各管分别加入四种ddNTPddATPddGTPddTTPddCTPDNA链末端合成终止法链末端合成终止法DNA链末端合成终止法基本流程链末端合成终止法基本流程待测待测DNA模板：模板：3TTGCACCTGA5引物：与模板引物：与模板3端互补端互补DNA聚合酶（聚合酶（DNA-Pol）dNTP底物（其中一种用底物（其中一种用32P标记）标记）四个试管中分别加入，反应一段时间。四个试管中分别加入，反应一段时间。ddGddAddTddC电泳三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列序列分析自动化的基础。分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸；用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸；然后进行然后进行Sanger测序反应；测序反应；反应产物经电泳（平板或毛细管电泳）分离；反应产物经电泳（平板或毛细管电泳）分离；通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。DNADNA自动测序结果举例自动测序结果举例
生物化学课件：第二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用
