一种新型ATP―依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP

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1、摘要：运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解 酶高活性类芽抱杆菌(Paenibacillus lautus) CHN26菌株的基 因组DNA为模板，经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型 CIpP家族蛋白水解酶PIcIpP基因，全长585 bp,编码194个 氨基酸，分子量约为21 ku。采用大肠杆菌(Eschericia coli) pET表达系统构建PIcIpP基因表达质粒pET-28-PIcIpP，并在 大肠杆菌 BL21 中实现了重组 PICIpP 蛋白的表达。利用组氨 酸标签(His-tag)亲和纯化法获得PICIpP纯化蛋白，发现 PICIpP 可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋

2、白复合物。 PICIpP 复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性，最适反应温度为 40 C、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PICIpP复合物的酶 活性，而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。 本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、CIpP家族蛋白酶的 基础理论和应用研究奠定了基础。关键词：CIpP家族蛋白水解酶；类芽抱杆菌；基因；克 隆；表达；酶学特性中图分类号：Q789文献标志码：A文章编号：002-1302 (2016) 05-0047-04蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的 60%，被广泛应用于 食品、医药、洗涤剂、农业等领域1。微生物是水解酶的主要来源，探索并开发微生物新基因资源

3、，对于解决目前商品 化酶制剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有 重要意义。CIpP (caseinolytic peptidase)家族 ATP-依赖型伴侣分子 相连(chaperone-linked)的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核 生物及真核生物中2,其利用ATP驱动蛋白底物解折叠并转 位进入蛋白水解腔(chamber)中降解成小分子肽3。1988 年，ClpP蛋白酶首次被发现于大肠杆菌(Eschericia coli )中 。此后的大量研究表明，大肠杆菌中ClpP蛋白酶(EcClpP) 由蛋白水解核心ClpP、依赖ATP的伴侣分子ClpA或ClpX组 成，其蛋白水解腔由催化位点序

4、列形成的 2 个反向同型七聚 体环构成2。在国外， ClpP 蛋白酶已商品化，而目前国内尚 无涉及 ClpP 家族蛋白酶的研究报道。此外，有关类芽孢杆菌 属(Paenibacillus spp.)中clpP基因功能的研究国内外均无报 道。采用基因克隆技术，以笔者所在实验室分离鉴定获得的 蛋白水解酶高活性类芽抱杆菌(P. lautus)CHN26菌株基因 组DNA为模板，克隆鉴定了该菌株的一种新型ATP-依赖型 ClpP 家族蛋白水解酶 PlclpP 基因，并在大肠杆菌 BL21 中实 现了异源表达。本研究结果为 ClpP 家族蛋白酶的基础理论和 应用研究奠定了基础。1 材料与方法1.1 试验材

5、料Mini BEST细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂 盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase 均购自宝生物工 程(大连)有限公司。限制性核酸内切酶BamH I和Hindill 购自Promega (美国)公司，Luria-Bertani (LB)培养基购自 北京陆桥技术有限责任公司。卡那霉素、氨苄青霉素、聚丙 烯酰胺和N, N -亚甲双丙烯酰胺等SDS-PAGE试剂、蛋白质 定量检测试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司。蛋 白裂解试剂 BugBuster Protein Extraction、纯化试剂 Ni-NTA His?Bindre

6、sin 均购自 Merck Millipore (德国)公司。0-酪蛋 白购自Sigma-Aldrich (美国)公司。大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21、基因克隆载体pGM-T (Ampr)均购自天根生物技术有限公司；基因表达载体 pET-28a (Kmr)购自 Merck Millipore (德国)公司；类芽抱 杆菌 CHN26 由笔者所在实验室分离鉴定并保存。1.2 试验方法1.2.1分子生物学方法采用Primer 5.0软件(http： / PlclpP 基因 PCR 扩增上、 下游引物 ClpP-P1f(5 -ATGGAGGATGAAACCATGAA-3 )、 ClpP-P1r(

7、5/ -TCACAGTTTGGTGACGATGT-3),以及在 5/端 分别引入限制性核酸内切酶BamH I、Hindill酶切位点(以 下划线表示)的上、下游引物ClpP-P2f (5/ -CGGGATCCATGGAGGATGA-3 )、 ClpP-P2r (5/-CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3，）。寡核苷酸弓I物合成、DNA 序列测定由生工生物工程（上海）有限公司完成，基因组和 质粒DNA的提取参照试剂盒说明书完成。参考Shi等的方法 进行PCR反应、产物纯化、酶切、DNA片段连接与转化、 菌落PCR检测等。采用Clustal 2.1软件（www.ebi.ac.uk/Too

8、ls/services）进行多序列比对分析。1.2.2 蛋白表达及纯化参考 Li 等的方法6进行 PlclpP 基 因表达质粒的构建、蛋白的诱导表达、组氨酸标签（His-tag） 亲和纯化、 SDS-PAGE 等。1.2.3蛋白水解酶活性的检测以0 -酪蛋白为底物，在150|J L 酶反应液2.7 |J g 0 -casein，5 |J L 0.1 mol/L ATP， 2 mmol/L ZnCl2, 50 mmol/L Tris-HCI（pH 值为 7.3）中加入 50 JL纯化酶进行反应。将40 C、pH值7.0条件下，30 min内 水解0酪蛋白使D562 nm值增加0.01的酶量定义为

9、1个酶 活性单位（U）。参考Li等的方法6测定温度、pH值，表 明活性剂（SDS、Tween-20、Tween-80）和蛋白酶抑制剂（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）对 PlClpP 复合物酶 活性的影响。 2结果与分析2.1蛋白水解酶高活性菌株类芽抱杆菌CHN26的分离鉴 定基于酶功能的筛选方法6，笔者所在实验室从东海水产养殖池塘底泥中分离获得1株蛋白水解酶高活性菌株，经16S rRNA基因序列测定(GenBank登录号为KF460030)分析及 生理生化鉴定，发现其为厚壁菌门(Firmicutes)芽抱杆菌纲(Bacilli)芽抱杆菌目(Bacill

10、ales)类芽抱杆菌科(Paenibacillaceae )类芽抱杆菌属(Paenibacillus )的细菌， 命名为类芽抱杆菌CHN266。笔者所在实验室对该菌株的多 种蛋白水解酶基因进行了研究，本次报道其中一种酪蛋白水 解肽酶clpP基因的克隆和表达。2.2 类芽抱杆菌 CHN26 的 PlclpP 基因分子克隆及序列分 析迄今为止，国内外涉及类芽抱杆菌中clpP基因功能的研 究尚无文献报道。本研究利用目前 GenBank 数据库中类芽抱 杆菌属Y412MC10菌株的全基因组信息(GenBank登录号为 NC_013406.1),基于其clpP基因序列设计了 PCR扩增引物 clpP-P

11、1f/r。提取类芽抱杆菌CHN26基因组DNA并以其为模 板进行PCR扩增，获得约0.6 kb的单一 PCR扩增产物。PCR 产物经纯化后与克隆载体pGM-T连接，转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞。筛选并提取Ampr阳性转化子重组质粒，经DNA 序列测定发现，克隆所得类芽抱杆菌CHN26的clpP基因全 长585 bp,编码194个氨基酸，预测分子量约为21 ku,将 其命名为 PlclpP。BLAST序列比对分析结果显示，PlclpP序列与GenBank 数据库中类芽抱杆菌属的ATP-依赖型ClpP蛋白酶水解亚单 位氨基酸序列的相似性为71%98%，而与EcCIpP的氨基酸 序列相似性仅为

12、 62%。然而 clpP 基因多序列比对分析结果显 示，PIcIpP基因序列含有S14_ClpP家族的特征性八肽结构域 （KDIHMYIN,第59个至第66个氨基酸）（图1），其中第59 个的赖氨酸（Lys58，K）、第60个的天冬氨酸（Asp59，D）、 第64个的催化亲核物质（catalytic nucleophile）酪氨酸（Tyr63, Y）为高度保守的催化三分体残基（catalytic triad residues）， 在酪蛋白水解中发挥重要作用。此外，PlclpP序列还含有 丝氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位点（Ser99-His124-Asp173） （图 1）。2.3Plcl

13、pP基因表达质粒pET-28a-PlclpP的构建与鉴定 基于本研究获得的 PlclpP 基因序列，设计了携带限制性 核酸内切酶BamH I和Hindill酶切位点的引物clpP-P2f/r，采 用PCR方法扩增PlclpP基因，获得单一 PCR产物。采用BamH I和Hindill双酶切PCR产物，回收纯化酶切产物。同时，提 取表达载体pET-28a的质粒DNA，经BamH I和Hindill双酶 切为线性的DNA片段，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 见图 2。将上述纯化后的酶切片段经T4-DNA连接酶连接后，转 化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有30 “g/mL卡那霉素 的LB琼脂平板

14、上，采用菌落PCR方法筛选获得阳性转化子 克隆（图2）。提取阳性转化子重组质粒DNA，经BamH I和 Hindill双酶切验证为单一 DNA片段插入，大小约0.6 kb （图 2）。经DNA序列测定，验证插入片段为PIcIpP基因。2.4PlclpP 基因的表达和纯化采用LB液体培养基（含30 M g/mL卡那霉素）于20 C 培养含有重组表达质粒的大肠杆菌 BL21（pET-28a-PIcIpP）， 通过0.6 mmol/L IPTG诱导表达18 h,获得含有组氨酸标签的 重组PlClpP蛋白，分子量约为21ku，与预测的ClpP蛋白分 子量大小相一致， SDS-PAGE 分析结果见图 3

15、。利用 Ni-NTA-His?Bind resin 纯化法纯化大肠杆菌 BL21 菌体裂解后 的无细胞提取液，经SDS-PAGE分析洗脱液各组分，获得了 纯化的目标蛋白PlClpP。在大肠杆菌BL21中异源表达的 PlClpP蛋白在SDS-PAGE图谱上呈现2个条带，分子量分别约 为21、25 ku （图3）。鉴于大肠杆菌EcClpP蛋白酶伴侣分子 CIpA、ClpX的分子量分别为80、46 ku9-10，推测PlClpP可 能与大肠杆菌 BL21 中未知伴侣分子形成复合物，未知伴侣 分子的序列和功能有待进一步研究。采用 BCA 蛋白定量试剂 盒检测 PlClpP 的表达量，结果显示， 1 g

16、 细胞湿质量可以产 生纯化的重组PlClpP蛋白复合物约0.54 mg，约占细胞总蛋 白的 5.25%。2.5PlClpP 复合物的蛋白水解酶活本研究以非折叠态模式底物B -酪蛋白为底物，在含有 2.5 mmol/L ATP的反应液中分析纯化PlClpP复合物在不同温 度下的蛋白水解酶活性，PICIpP复合物的最适反应温度为 40 C （图4）,明显高于类芽抱杆菌CHN26和大肠杆菌BL21 的最适生长温度37 C。同时分析了该复合物在不同温度下 的稳定性，结果显示，PICIpP复合物在1040C下处理3h 后相对酶活性仍高于 90%，进一步证明了 PICIpP 复合物的嗜 中温反应特性（图4

17、）。此外还分析了 pH值对PICIpP复合物 蛋白水解酶活性的影响，结果显示，该复合物的最适反应 pH 值为7.0。在强酸（pH值W6.0）、强碱（pH值$7.0）条件下 于4 C处理12 h后,相对酶活性迅速减弱，而在pH值6.0 7.0 条件下相对酶活性强于 87%，证明 PICIpP 复合物的中性 pH 值反应特性。2.6表面活性剂和蛋白酶抑制剂对 PICIpP 复合物酶活性 的影响分别采用SDS、Tween-20、Tween-80表面活性剂于40 C 条件下处理纯化的PICIpP复合物1 h，并在最适温度和pH值 条件下测定残余酶活。结果显示，终浓度为 0.5%的表面活性 剂强烈抑制P

18、ICIpP性复合物的酶活性50%60%； PICIpP复 合物对常规丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗性， 10 mmoI/L PMSF处理PICIpP复合物1 h对其酶活性无明显影响，表明 PICIpP 属于一类非常规的丝氨酸蛋白酶。 3 结论运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活 性类芽抱杆菌CHN26基因组DNA为模板，经克隆鉴定该菌 株为一种新型蛋白水解酶基因PIcIpP，编码194个氨基酸， 分子量约为21 ku。PICIpP氨基酸序列含有保守的CIpP家族 特征性八肽结构域（KDIHMYIN,第59个至第66个氨基酸）， 以及丝氨酸蛋白水解酶保守的催化活性位点（Ser99-H

19、is124-Asp173）。采用大肠杆菌的pET表达系统构建 了 PIcIpP基因表达质粒pET-28-PIcIpP，在大肠杆菌BL21中实 现了重组PICIpP蛋白的表达。利用组氨酸标签（His-tag）亲 和纯化法获得了 PICIpP 纯化蛋白，发现 PICIpP 可能与宿主菌 未知伴侣分子形成蛋白复合物。PICIpP复合物具有ATP-依赖 型酪蛋白水解酶活性，最适反应温度为40 C、pH值7.0o 终浓度为0.5%的表面活性剂SDS、Tween-20、Tween-80均强 烈抑制PICIpP复合物的酶活性，而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF）对其活性无抑制作用。本研究填补了我国CIpP家

20、 族蛋白水解酶研究领域的空白，为开发蛋白酶新基因资源、 CIpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。参考文献：1 Krik O， Borchert T V， FugIsang C C. IndustriaI enzyme appIicationsJ. Current Opinion BiotechnoIogy， 2002， 13（4）： 345-435.2 Kress W， MagIica Z， Weber-Ban E. CIp chaperoneeproteases：structure and functionJ. Research in Microbiology，2009，160：6

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