分子生物学实验讲义

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1、实验一 植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电

2、泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大

3、多数核酸酶所需的辅助因子镁离子。最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。三、实验方法 1向10 mL离心管中加入5 mL的2CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），60保存预热，预热后加入10 L 0.

4、2%的巯基乙醇, 巯基乙醇的作用为抗氧化剂。2用液氮将研棒、研钵预冷，将0.5-1.5 g叶片放入研钵，捣碎成粉末，转移到中的离心管中，轻轻转动离心管，使植物组织在提取缓冲中均匀分离,置于60水浴摇床中保温30min。3加入等量5 mL氯仿，于空气摇床中摇15min，使管内混合物成乳浊液，此时蛋白质充分接触氯仿与核酸分开，室温4000rpm离心15min分相，含蛋白质胞碎片的有机相位于管的下面，上层为含核酸的水相。4离心后，用去头的Tip（怕破坏DNA长链）将上清液转移到新的离心管中，将2/3量即3.3 mL预冷的异丙醇与之缓慢混匀，20，8000rpm离心10mim，沉淀DNA。5移去上清液

5、，干燥后（用无菌操作台通风干燥）加1 mL TE溶解沉淀。6加入5 L RNase（10mg/mL）37保温45min，以去除DNA中的RNA。7加入等量（1 mL）苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）,室温空气摇床缓缓混匀10 min,室温下4000rpm离心10min，进一步去除蛋白质,用去头的200 L Tip将上清转移到一支新的离心管中。8加入1/2量（0.5 mL）苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）,摇床缓慢混匀10min，4000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中。9加入等量（0.8-1 mL）氯仿，摇床摇匀10min，4000rpm离心10min，将上清液移到新管中,这一步

6、可除去水相中残留的酚。10加入1/10量（0.1 mL）3M NaAc，2.5倍量（2.5mL）冷乙醇，缓慢混匀，DNA沉淀析出，4000rpm离心10min。11弃去上清，干燥30-60min，加入0.5-1mL TE ，4溶解并保存。四、实验要点1CTAB溶液在低于15时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热。2在最适条件下，DNACTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特别是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNACTAB沉淀。3饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA

7、酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用苯酚和氯仿的混合液，可减轻这两种现象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚氯仿异戊醇=25:24:1），异戊醇的作用是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。五、所需仪器、耗材六、所需试剂1CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）2巯基乙醇3液氮4氯仿5冷异丙醇6TE缓冲液7RNase8苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）93M NaAC10冷乙醇七、试剂配制11MTrisHCl，pH=8.020.5M EDTA Na22H2O，pH=8.032CTAB4TE缓冲液53M NaAC（pH=5.2）60.2% 巯基乙醇720SSC810mg/mL R

8、Nase A八、思考题1提取缓冲液中CTAB或EDTA的作用是什么？2怎样去除DNA杂质中的蛋白质和RNA？3纯化DNA步骤中，苯酚、氯仿、异戊醇各有什么作用？为何交替使用？实验二 RNA的分离一、RNA和无RNA酶的环境在植物细胞中存在不同类型的RNA。rRNA占总RNA的70%;tRNA在细胞中的含量也较丰富（15%），mRNA含量为细胞总RNA的1-5%,大多数真核细胞mRNA在其3端均有一多聚A(Poly A)尾巴。在进行RNA操作时，需要特别注意RNA被RNA酶降解。由于RNA酶存在于所有的生物中，并且RNA酶是一种耐受性很强的酶，传统的高温灭菌的方法不能使之失活。RNA酶的污染既可

9、能源自内部，在植物的某些组织如根中RNA酶含量特别高，也可能源自外部，如玻璃器皿，缓冲液和操作者的皮肤。其中人的皮肤表面有大量的RNA酶。所以应尽可能在无RNA酶的环境下进行有关RNA操作,具体措施如下：1分离RNA以前，将所用玻璃制品及取样剪刀、镊子等置于烤箱在300下烧烤4h或180烘烤8h以灭菌。2应用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC-SDW）进行溶液的配制，并高压灭菌20min。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。DEPC-SDW配制如下：100mL水中加入0.2mL DEPC原液，放于摇床上充分混匀并在室温下作用数小时，然后高压灭菌15min。3所用的Tip、离心管、PCR管等塑料制品都

10、用0.05% DEPC-H2O处理：灌满DEPC-H2O，37放置2小时，用DEPC-SDW冲洗 ，并于100干烤15分钟并高压灭菌15分钟。4人的汗液中含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换，通常使用的实验室设备诸如移液吸管等应浸泡于酒精中，使用前晾干。二、实验原理总RNA提取采用一步法进行（TRIzoL试剂），试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，是由Chomczyanski和Sacchi发展的一种改进的提取RNA的方法。在进行样品均质化和溶解过程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以保持RNA的完整性。由于RNA

11、在碱性条件下不稳定，因而在整个提取RNA过程中体系始终保持酸性至中性，而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起变性后被离心下来，这时溶液分为液体相和组织相，RNA可以完整地保存在液体相中。在提取液体相后，加入异丙醇来沉淀RNA，最后用75%乙醇来洗RNA。三、实验方法（一）均质化及分相1玻璃研磨器中放1mL TRIzol RNA提取液2冰上研磨3研磨液移入1.5mL离心管，室温放置5分钟。4加入0.2mL氯仿，盖好盖，用手（或vortex）剧烈振动15秒。5再在室温下放置2-3分钟。64条件下12000g离心15min，离心管中共分三相，上层为RNA液体相，中层为DNA及碎破组织相

12、，下层为酚-氯仿相。7上清液RNA液体相移入新的离心管中。（二）RNA沉淀8与0.5mL的异丙醇混匀后，室温放置10分钟（洗氯仿，沉淀RNA）。94离心12000g 10分钟。（三）洗涤10倒掉上清液后加入1mL的75%乙醇振荡（vortex）洗RNA（洗掉异丙醇）。114条件下7500g离心5分钟。（四）重溶RNA12去掉乙醇。13干燥10分钟。14用DEPC-SDW 50 L溶解RNA沉淀，可在55-60条件下温育10min。15加入3倍体积的无水乙醇（150 L）放入-20或-80下保存。四、所需仪器、耗材五、所需试剂1TRIzol试剂2氯仿3异丙醇475%乙醇（用DEPC-SDW配制）

13、5DEPC-H2O六、思考题1 TrizoL试剂在实验中的作用是什么？2 实验过程中，加入氯仿后，溶液共分为哪三相？3 怎样达到尽可能的无RNA酶的环境？实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测一、实验原理分离出细胞的总RNA或部分RNA之后，根据它们相应的迁移可以通过电泳分辨RNA分子，是检测RNA分子是否降解的关键一步。电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA/RNA长度增加时，来自电场的驱动力和

14、来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。（一）琼脂糖凝胶1琼脂糖浓度采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子。2EB染料的存在溴化乙锭（EB）是

15、一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.123电泳缓冲液的组成有几种不同的缓冲液可用于电泳，分别为 Tris乙酸（TAE）、Tris硼酸（TBE）或Tris磷酸（TPE），其浓度约为50mmoL/L，PH为7.57.8,这些缓冲液均含有EDTA

16、。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。常用的电泳缓冲液的配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris乙酸（TAE）1：0.04moL/L Tris乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱57.7mL 冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱15.5mL 85%磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris碱27.5g

17、硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)4加样缓冲液：缓冲液类型 6缓冲液贮存温度I 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液4II 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液室温III 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液4IV 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）4 V（碱性加样缓冲液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚绿 025%二甲苯青FF4加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更

18、为便利，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。选用哪一种加样缓冲液纯属个人喜恶。5DNA片段长度标记DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker,本实验使用Gene RulerTM DNA Ladder Mix 为DNA片段长度标记，分别由100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1031 bp、1200 bp、1500 bp、2000 bp、2500

19、bp、3000 bp、3500 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、10000 bp 组成，DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。二、实验方法150TAE的稀释：如制备50mL 1TAE，取1mL 50TAE加入49mL水定容至50mL。2制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60，加入浓度为10mg/mL的EB 2L，使EB的终浓度为1g/mL。3用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置1

20、0分钟，然后用DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。4用胶带封住胶床，放好梳子。5将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固2060min。6在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子和胶带，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。7向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。8分别将RNA样品与加样缓冲液混合，（10L RNA样品+2L 6加样缓冲液），用移液枪将12L样品加入加样孔。9正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。10电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察，可以看到提取完整的RNA共有三条带，分别是5kb的28S rRNA, 2kb 1

21、8S rRNA及0.10.3kb的5S rRNA及tRNA，可以看到28S rRNA的含量约为18S rRNA含量的2倍，说明总RNA完整性良好，无降解。三、注意事项溴化乙锭溶液的净化处理： 溴化乙锭是强诱变剂，有中度毒性，可致癌，使用这一染料时务必戴上手套。1溴化乙锭浓溶液（浓度0.5mg/mL）的净化处理。加入足量的水使EB的浓度降低至0.5mg/mL以下。加入1倍体积的0.5moL/L KMnO4，小心混匀后再加1倍体积的2.5moL/L HCL，小心混匀，于室温放置数小时。加入1倍体积的2.5moL/L NaOH，小心混匀后可丢弃该溶液。2溴化乙锭稀溶液（如含0.5g-1g/mL溴化乙

22、锭的电泳缓冲液）的净化处理。 每100mL溶液中加入100mg粉状活性炭。于室温放置1小时，不时摇动。用滤纸过滤溶液，丢弃滤液。用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害物予以丢弃。四、所需仪器、耗材五、所需试剂1 EDTANa22H2O（乙二胺四乙酸二钠盐）2 溴化乙锭（EB）3 琼脂糖4 Tris（三羟基氨基甲烷）5 冰醋酸6 溴酚蓝7 蔗糖或甘油8 二甲苯青FF六、试剂配制1加样缓冲液：（6）IV型 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液 如配50mL，加入0.125g溴酚蓝，20g蔗糖，混匀，定容至50mL，4保存。2TAE，50浓缩贮存液： Tris 242g，冰醋酸57.1mL，10

23、0mL 0.5moL/L EDTA, PH=8.0，加600mL水剧烈搅拌，定容至1000mL。30.5moL/LEDTA， PH=8.0 在800mL水中加入186.1g EDTANa22H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的PH值至8.0（EDTANa22H2O在溶液PH值接近8.0时，才能完全溶解），然后定容至1 L，分装后高压灭菌备用。4溴化乙锭贮存液（10mg/mL）： 在100mL水中加入1g溴化乙锭，用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转移至棕色瓶中，4贮存。七、思考题1 加样缓冲液的作用是什么？2 琼脂糖中加入EB的作用是什么？3 电泳时，为什么DNA/RNA分子将向阳

24、极移动？实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整一、实验原理在分子生物学实验中，提取DNA或RNA后，往往需要测定其纯度和浓度，在纯度达到标准，浓度调整到所需浓度后，才能进行下一步实验。有条件的实验室，利用DNA/RNA计算器，能够很方便、很迅速地测定DNA/RNA浓度和纯度，但DNA/RNA计算器往往很昂贵。一般实验室常利用紫外分光光度计来测定DNA/RNA的浓度。1对于DNA，根据其在260、280、310nm下紫外吸收值A260、A280、A310，可确定其纯度和浓度。对于dsDNA：1.0A260=50g/mL ssDNA：1.0A260=33g/mL纯DNA溶液的A260/

25、280应为1.80.1，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。A310值是背景，若盐浓度较高，A310值也高。2对于RNA，根据其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。1.0A260=40g/mLA260/A280应介于1.72.0之间如果A260/280比值太小，说明可能RNA样品中污染了蛋白或苯酚。A260/A230的比值应该大于2.0，否则就可能被异硫氰酸胍（TRizoL试剂成分）污染了。二、实验方法1测定前，石英比色杯须用浓盐酸：甲醇=1：1溶液浸泡1小时，随后用DEPC-SDW彻底冲洗。2以实验三中最终提取的RNA

26、样品为例。原RNA样品中共有200L水，向样品中加入2L 3moL/L PH=5.2的乙酸钠溶液，使其终浓度为0.03moL/L，充分混合进行沉淀，4 12000g下离心5min，去上清液，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，晾干，然后用DEPC-SDW 20L溶解RNA。3用DEPC-SDW对待测样品做1：1000倍数稀释（2L样品加入1.998 mL DEPC-SDW）。4分别测定样品的A260、A280及A230。5分别计算样品A260/A280及A260/A230的比值。三、所需仪器四、所需试剂1 浓盐酸2 甲醇3 乙酸钠4 DEPC-SDW五、试剂配制3moL/L乙酸钠（PH5.2）250m

27、L 溶液的配制：在200mL DEPC-SDW中溶解 102.025g三水乙酸钠，用冰乙酸调节PH值至5.2，加入25L原溶液DEPC，然后定容至250mL，放置过夜，高压灭菌15min。六、思考题1 怎样确定DNA或RNA溶液的浓度？2 根据你所测得的DNA或RNA的浓度，试计算如果把溶液浓度调节到01g/L应向溶液中加入多少L的水？实验五 聚合酶链式反应（PCR）一、实验原理聚合酶链式反应（PoLymerase chain reaction, PCR）是一项体外特异扩增特定DNA片段的核酸合成技术，这项技术是分子生物学研究领域的一次创举。PCR通常需要两个位于待扩增片段两侧的寡聚核苷酸引物

28、，这些引物分别与待扩增片段的两条链互补并定向，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增。反应过程为首先必须使得待扩增DNA（称为模板）置于高温下解链成单链模板，这一过程叫变性；第二步为分别与待扩增的DNA片段两条链的3端互补的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer 15-20bp）在低温条件下分别与模板两条链两侧互补结合，这一过程叫退火，第三步是DNA聚合酶在适当温度下将脱氧核苷酸（dNTP：dATP, dCTP, dTTP dGTP）沿引物53方向延伸合成新股DNA，这一过程叫延伸。变性退火延伸，如此循环往复，每一循环产生的新股DNA均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式即2n扩增

29、的，经过30-35个循环，目的片段可以扩增到一百万倍，在一般PCR仪上，完成这样的反应需几个小时。PCR原理示意图二、实验方法1在冰上，建立如下PCR反应体系，在PCR管内分别加入： 10PCR缓冲液 2L 25mM dNTPS 1.6L 25mM MgCl2 1.2L Primer 1（10M） 0.8L Primer 2（10M） 0.8L 模板DNA（1g/L） 1L Taq酶（5/L） 0.2L dd H2O 12.4L 总体积 20L2将PCR管放入PCR仪中，按如下程序操作。 94预变性2min (开始时模板DNA变性要适当延长) 94变性1 min 36退火1 min 72延伸2

30、 min,共40个循环 72延伸7 min（最后一次延伸的时间也要适当延长） 4贮存。 3取15L反应产物进行当琼脂糖凝胶电泳检测。三、PCR优化要得到预期的PCR扩增效果，从中选定最为适用、重复性最好的条件，要试用不同的反应组分和循环参数，其中Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素对实验结果都有很大影响，在预备实验中，应分别进行梯度实验和交互组合实验，最终确定优化的PCR反应体系。四、所需仪器、耗材五、所需试剂1随机引物（Primer）（10M）2. dNTP(25mM)3. 模板DNA（1g/L）4TaqDNA聚合酶（5/L）5. 10PCR缓冲液6TBE7加样缓冲

31、液8MgCl2（25mM）六、试剂配制1琼脂糖凝胶电泳所需试剂同实验四一样。2引物的配制：订购的引物大多为干粉，附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解、调整浓度后，盖上管盖，充分上下振荡510分钟，不用时在-20以下保存。在干粉管上一般都标有260nm下的吸光值，并标出碱基对数，例如一个管标为5 OD的20 mer oLigo DNA意思为一个20bp, 260nm下吸光值为5 OD的寡聚DNA。分子量（MV）=（A碱基数312）+（C碱基数288）+（G碱基数328）+（T碱基数303）-61分子量也可以用以下近似方法计算：一个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近

32、似为324.5，则一个引物的分子量=碱基数324.5例如：现有一个引物管标为0.2 OD 10 mer如配制引物浓度为10M,方法如下：分子量=10324.5=3245质量数=0.233=6.6g (1 OD ssDNA=33g)摩尔数=6.6g/3245=0.002 moL=2 nmoL（2 nmoL/10M）1000=200L所以应加200L水，此管引物才能调整为10M。七、思考题1 PCR的反应原理是什么？2 PCR反应体系包括那些成分？实验六 随机扩增多态性DNA反应（RAPD）一、相关知识 遗传标记（genetic markers）是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。其方法

33、主要有4种类型，即形态标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）、生化标记（biochemecal markers）和分子标记（molecular markers）。与前三种标记相比，分子标记具有以下优越性：（1）直接以核酸作为研究对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，不受季节、环境限制，与发育时期无关，可用于植物基因型的早期选择。（2）标记数量极多，遍及整个基因组。（3）多态性高，由于自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料。（4）由许多分子标记表现为共显性（codominance），能够鉴别出纯合基因型与杂合

34、基因型，可提供完整的遗传信息。目前，常用的分子标记技术主要有限制性长度片段多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）、染色体或基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）、mRNA差别显示（mRNA different

35、ial display，mRNA-DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、消减杂交法（subtractive hybridization，SH）、代表性差异分析法（representation difference analysis，RDA）、任意引物PCR（arbitrary-primer PCR，AP-PCR）、DNA扩增指纹（DNA amplified fingerprinting，DAF）、单引物扩增反应（single primer amplification reaction，SPAR）、顺序表达位点扩增（sequ

36、enced characteried amplified region，SCAR）、加锚微卫星寡核苷酸（anchored microsatellite oligonucleotide，AMO）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、序列标签位点（sequence-tagged site，STS）等等。二、实验原理RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为十聚体）为引物，模板在92-94变性解链后，如果双链DNA分子在一定长度内具有反向平行又与引物互补的片段，引物的位置是在彼此可

37、扩增的距离内（引物间距为200-2000bp），那么不连续的分子量为200-2000bp的DNA片段就会通过PCR产生。高温变性、低温退火、适度延伸，如此往复循环，经过3040个循环，产物即可扩增到百万倍以上，如此高产的DNA片段经电泳分离和EB染色后，直接在紫外观察和照相。RAPD技术简单、容易掌握，在短期内可获得大量的遗传标记，这些优点逐渐被人们接受后，发展神速，短短三年中在生物学的诸多领域，如遗传指纹作图、检测遗传多样性与稳定性（品种鉴定、物种起源与进化）等。三、实验方法（一）DNA的提取 同前CTAB法。（二）纯度检测及浓度调整 同实验四。（三）操作程序1反应体系的制备冰上建立如下反应

38、体系，夹取一支PCR管，分别加入下列成分：10PCR Buffer 2.0 l模板DNA（500ng/l） 1.0 ldNTPs（2.5mM） 1.6 lMgCl2 （25mM） 2.0 lPrimer（20M） 1.2 lTaq酶（2.5U/l） 0.5 l 加ddH2O至总体积 20.0 l 上下吸打混匀，离心收集。矿物油封盖。2扩增程序然后将PCR管放入PCR仪中，按如下程序操作。94，预变性5min；94变性1min，37退火1min，72延伸2min，40个循环；72延伸7min，4保存。3琼脂糖凝胶电泳检测 方法同实验三，胶浓度为2%。四、反应的影响因素及注意事项（一）影响因素在R

39、APD反应过程中，涉及的反应因子很多，且对反应条件敏感，任何一个反应因子设置不当，都会影响整个反应的过程，或者改变带型。通常情况下，实验室要系统地探索各反应条件及影响因子，优化反应体系，得到一个实验条件标准的RAPD反应。反应过程中的影响因子主要有Taq酶、Mg2+浓度、扩增反应温度和时间、循环周期、引物、dNTPs浓度和DNA浓度及纯度等。因而在实验前要对反应体系及扩增条件进行充分的优化。（二）注意事项1冰上配制PCR反应液，然后置于PCR仪上进行反应。2DNA质量要求高，应纯化并特别注意防止氧化。3反应灵敏，易产生污染而造成假阳性，因此要有对照反应。4注意影响因素，并注意“平台效应”的产生

40、。5若产物的特异性较低，则可在反应混合物中加入5%的二甲基亚矾（DMSO）等以提高产物特异性。6如若产物在琼脂糖凝胶上分辨率较低，则可用聚丙烯酰胺凝胶或梯度凝胶电泳方法来提高分辨率。五、所用仪器、耗材PCR仪；微量移液器；离心机；紫外分析仪；电泳装置；PCR管；无菌Tip头；玻璃器皿等六、所需试剂10PCR Buffer；模板DNA；dNTPs（2.5mM）；MgCl2 （25mM）；随机引物（20M）；Taq酶（2.5U/l）；加样缓冲液；琼脂糖等。七、思考题1试述RAPD技术与PCR技术的区别。2试述为什么RAPD技术重复性较差？实验七 甜菜M14品系AFLP分析一、相关知识（一）基因组D

41、NA限制性核酸内切酶酶切在基因工程技术中，酶切反应为一个关键性的操作过程，选择合适的限制性内切酶，将载体切成符合要求的片段，以便于外源基因的插入。核酸内切酶就是从DNA链的内部进行切割的酶。核酸内切酶分为两类，一类称为非限制性内切酶，另一类称为限制性内切酶。非限制性内切酶就是指那些不识别特定的DNA序列进行切割的内切酶，如脱氧核糖核酸酶（DNase ），是从牛的胰腺中提取出来的内切酶，DNase 对单、双链DNA都很敏感。它可以在DNA链内的任意位置切断磷酸二酯键，没有特定的识别序列。一般说来，经DNase 酶解处理过的DNA体系中最终只会剩下被降解下来的单核苷酸和很短的寡聚核苷酸链。限制性内

42、切酶则与非限制性内切酶相反。它们都能识别一定的DNA序列，在一定的条件下切断DNA链。限制性内切酶分成三种类型，即类型限制性内切酶识别的DNA序列长约十几个核苷酸，或甲基化，或在离该识别序列一端约1000bp的位置上切割DNA，类型限制性内切酶只特定地识别DNA序列，而切割位点却不特定；类型限制性内切酶与类型限制性内切酶有些不同，它也可识别特定的DNA序列，但它切割DNA的位点，往往在识别结合位点很相邻的位置上而不是1000bp那么远；尽管如此，它的切割位点仍就不特异。因而型限制性内切酶与 型限制性内切酶在基因操作技术中的应用前景并不广泛。类型限制性内切酶不但能特异识别DNA序列，而且识别的D

43、NA序列与酶切割DNA的位置是一致的，它避免了酶切末端的不确定性和可重复性，因而在基因重组技术中有广泛使用。大多数的限制性内切酶并不是在DNA两条链的同一个位置切断的，而是两条链错开两至四个核苷酸断裂，这样产生的DNA末端会带有5突出或是3突出的DNA单链，这种末端称为粘性末端。酶切通常根据操作目的的不同而选择不同的酶切方式，如单酶切、双酶切、部分酶切等等。单酶切是DNA片段化最常用的方法，用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品。而双酶切的两种限制性核酸内切酶可以先后分别在不同的反应系统中切割DNA样品。采用这种方法，应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高

44、盐浓度缓冲液的酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。（二）粘性末端的连接在细胞中，行使连接功能的是连接酶（ligase），这是一类很特殊的酶，它催化DNA或RNA相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口封合起来。常用的连接酶主要有DNA连接酶和RNA连接酶，其主要作用为间断修复功能和连接功能。理论上讲，连接反应的

45、最佳温度是37，因为在37时连接酶的活性最高，但在实际实验中，37时粘性末端DNA分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们需要找到一个最适温度，它既要利于最大限度地发挥连接酶的活性，又要有助于短暂配对结构的稳定。目前，常用的连接温度为12-16。由于粘性末端比平末端具有更高的连接效率，因此，在做DNA重组连接实验过程中，人们往往优先选择粘性末端连接。但实际上，并不是所有的连接都已具备了合适的粘性末端，例如大多数情况下一个是粘性末端分子，另一个是平末端DNA，或是两个分子分别具有不同的粘性末端等等。在这些情况下，人们可以采用衔接体（linker）技术、接合体（adaptor）技术和同聚体（homo

46、 polymer）加尾技术等。（三）选择性PCR扩增原理与标准的PCR完全相同，区别仅在于PCR所用引物不同。标准PCR的引物为已知序列互补的核苷酸顺序，而选择性扩增中，针对中间未知的核苷酸顺序人为的在已知顺序引物的后面随机加上13个碱基（要保证一定的GC含量），这样只有与随机的三个碱基互补配对的片段才可能从大量的片段中被扩增出来，因而可根据选择性碱基的数目来控制扩增片段的多少，达到选择性的目的。引物的组成：（1）核心碱基序列，该序列与人工接头互补；（2）限制性内切酶识别序列；（3）引物3端选择碱基。（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺

47、凝胶电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。常用聚丙烯酰胺凝胶有以下两种：（1）用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶大多数双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率大略与其大小的1g对数值成反比，但迁移率也受其碱基组成和序列的影响，以致大小完全相同的DNA，其迁移率可相差达10%，这种作用是由于双链DNA在特定序列上形成扭结而造成的。（2

48、）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶这些凝胶在一种可以抑制核酸中的碱基配对的试剂（如尿素或甲醛）存在下聚合，变性DNA在这些凝胶中的迁移速率几乎与其碱基组成及序列完全无关。放射性DNA探针的分离、S1核酸酶消化产物的分析及DNA测序反应产物的分析，均采用变性聚丙烯酰胺凝胶。（五）AFLP技术1AFLP技术的优点理论上由于AFLP采用的限制性内切酶和选择性碱基的种类、数目较多，所以AFLP可产生的的标记数目是无限的；基因型的AFLP分析，每次反应产物经非变性PAGE电泳检测到的谱带数在50100条之间，所以该技术是DNA多态性检测的一个非常有用的技术；AFLP标记是典型的孟德尔方式遗传

49、；AFLP分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，因此AFLP标记可以用于作为遗传图谱和物理图谱的位标；AFLP 既可以用于分析不同复杂程度的基因组DNA，也可用于分析克隆的DNA大片段，因此它不仅是一种DNA指纹技术，也是基因组研究的一个非常有用的工具；DN A的随机扩增，受模板浓度的影响较大，而AFLP的一个重要特点是对模板浓度变化不够敏感。VOs等人在西红柿的 AFLP分析过程中发现模板浓度相差1000倍的范围内，得到的结果基本一致。只是模板浓度很低时，谱带较弱，甚至有缺失；AFLP技术另一个重要特点是，在反应过程中，标记的引物会全部耗尽，当引物耗尽后，扩增带型将不受循环数的影响。

50、由于AFLP对模板浓度不敏感，这样利用过剩的循环数，即使模板浓度存在一些差异，也会得到强度一致的谱带。因此AFLP技术能够检测谱带强度的多态性。2AFLP与其它分子标记技术的比较每一种分子标记都具有其优点和缺点。对于相同的材料，用不同的分于标记揭示的多态性是存在差异的，一般AFLP的多态性比率最大，RFLPRAPD次之。Wang等在对水稻温敏不育等位系的研究中报道，三种分子标的多态性比率依次为AFLPRAPDRFLP（26.67%；4.00%；1.67%）。同时Lin等在大豆的分析中同样证明AFLP的多态性最高。特性 RFLP RAPD AFLP 分布 普遍 普遍 普遍 可靠性 高 中等 高

51、重复性 高 中等 高 遗传性 共显性 显性 显性或共显性 多态性 中等 高 非常高 DNA需求 230ng 1-100ng 100ng 放射性 一般有 无 有或无 技术难度 中等 简单 中等 样品生产率 中低 高 非常高 时间因素 长 快 中等 与其它分子标记相比，AFLP的特点主要表现在它结合了RFLP及RAPD各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，试验结果稳定可靠，可以快速获得大量的信息。而且再现性高，重复性好，因而非常适合于品种指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。在一些多态性很少而且待测样品较少的情况下，

52、用AFLP分析能达到满意的结果。对高密度基因图谱的绘制或对某个基因所在区域的精细作图，AFLP是较为理想的方法。AFLP所产生的多态性远远超过了RFLP、RAPD等，目前被认为是DNA指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。3AFLP技术的应用AFLP技术诞生以来，己广泛地用于生物的基因组分析。如植物的抗性基因定位及染色体作图，病原菌的亲缘关系分析。由于它对基因组的微小变化具有较好的分辨能力，因而它也被广泛地用于同一病原真菌的营养体的亲和群及病菌的无毒基因与病菌的毒性分析。AFLP技术用于细菌的分类和鉴定的研究ALFP的可重复性比RAPD要强，在细菌分类方面的适用范围与RAPD、RFLP和细菌

53、可溶性蛋白质谱相似。但AFLP综合以上各方法的优点，分辨率仅低于全基因组序列分析，稳定性强，可提供更为丰富的分类信息。AFLP技术用于真菌分类研究AFLP是一种强有力地表示真菌分子特征的新技术，其操作过程方便，区分鉴定结果可靠，该技术在病原真菌方面的应用己十分引人注目，己发展出一些实用的程序来区别一些特殊菌株，用于分型、鉴定并研究其亲缘关系。它可以分析其不同种属间的差别，甚至还可以揭示种内不同菌株间的细微差异，从而弥补了表型分型的不足，更为精确地分析致病真菌本质上的差异。该技术被应用于镰刀菌（Fusarmiu graminearum）不同来源分离株的鉴定和区别，得到了良好结果。二、实验原理19

54、91年，Gustava等人用非常短的5个碱基、8个碱基及10个碱基的寡核苷酸片段作引物，随机扩增人、动物、植物、真菌、细菌以及病毒DNA获得成功，他们称之为扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphisms，AFLP）。1992年由Zabeau 和Vos创立的AFLP技术与前述内容大不相同，该方法结合了RFLP(restriction fragment Length polymorphisms)技术和RAPD技术的特点，使用人工接头（Adaptor）与限制性内切酶酶切的基因组DNA片段连接并以此为DNA模板，合成系列3末端随机变化数个碱基

55、且与人工接头序列相互补的PCR引物，来进行PCR特异条件扩增，经电泳检测后可获得DNA指纹图谱。基因组DNA CTGCAGNNNNNNNNCTGCAGGACGTCNNNNNNNNGACGTCPst酶切 GNNNNNNNNCTGCAACGTCNNNNNNNNG 加人工接头5-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-33- CATCTGACGCATGT -5T4连接酶连接CTCGTAGACTGCGTACA TGCA GNNNNNNNNCTGCACATCTGACGCATGT ACGT CNNNNNNNNG 选择引物PCR扩增CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNNNNNNCTGCAC

56、ATCTGACGCATGTACGTCNNNNNNNNGPs1-GACTGCGTACATGCAGACCPs2GACTGCGTACATGCAGCTG凝胶检测（一）基因组DNA限制性核酸内切酶酶切限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度、缓冲体系、离子种类与浓度、DNA的纯度、DNA分子的甲基化程度等等。限制性内切酶的反应缓冲液中一般含有MgCl2，NaCl或KCL，Tirs-HCl，二硫苏糖醇（DTT）或-疏基乙醇，有的还含有牛血清蛋白（BAS）。Mg2+是限制性内切酶的辅助因子，Tris-HCL保持整个反应体系的pH值；不同的酶对于Na+或K+有不同的要求，DTT和-疏基乙醇有助于

57、酶在体系中的稳定。DNA的纯度对于酶切效果影响很大，因为蛋白质、酚、氯仿、SDS等杂质污染DNA以后，能直接抑制酶的活性。在实验时，为了克服这些杂质的影响，采取的措施或者是延长反应时间，或是增加酶量，也可以既增加酶量，又延长反应时间取得好的反应效果。不同的限制性内切酶，其最适反应温度也可能不同，内切酶标准反应温度为37，但也有许多例外，如Sma I 的最适反应温度为25，Taq I 的最适反应温度为65。内切酶的活性定义：在50 L反应液中，适宜的温度下反应1小时，将1g的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位。限制性内切酶的贮存液通常含有50%的甘油，而甘油在反应体系中超过5%时，就会影响酶

58、切的特异性，因此作酶切反应时加入酶的体积不应超过反应总体积的1/10。酶切的时间因实验而异，是由DNA样品的浓度、纯度及酶的浓度决定的。DNA样品浓度高、纯度差或酶的浓度太低都可以适当延长酶切时间。酶切体系的体积一般以20-50 L为宜。如果DNA样品是基因组DNA，那么时间可以延长至18个小时或过长。EcoR ：5-GAATTC-3 5-G AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5Pst :5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-33-GACGTC-5 3-G ACGTC-5BamH :5-GGATCC-3 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5（二）接头的连接adaptorT4 DNA连接酶T4 DNA连接酶adaptoradaptoradaptor（三）选择性PCR扩增（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶（poLyacryLamide geL, PAG）是由丙烯酰胺（acryLamide）和交联试剂N，N甲叉双丙烯酰胺（Bis；N，NmethyLenebisacryLamide）在有引发剂如过硫酸胺和增速剂如N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED)存在的情况下聚合而成的。丙烯酰胺的单体形成长键，由N,N甲叉双丙烯酰