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1、ACE基因的多态性掌握从微量来源的组织细胞中掌握从微量来源的组织细胞中抽提抽提基因组基因组DNADNA掌握掌握PCRPCR技术原理技术原理了解了解基因多态性分析基因多态性分析的方法。的方法。基因诊断基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的方：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，从法，从DNADNA、RNARNA水平检测基因的存在、结构异常和水平检测基因的存在、结构异常和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。基因多态性基因多态性：指在一随机婚配的群体中，染色体同：指在一随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可一基因座位点上有两种
2、或两种以上的基因型，它可决定人体对疾病的决定人体对疾病的易感性易感性、临床表现多样性和对药、临床表现多样性和对药物治疗反应的差异性。物治疗反应的差异性。理论基础理论基础 ACEACE基因第基因第1616内含子存在一段长度为内含子存在一段长度为287bp287bp（Alu序列）的序列）的插插入入/缺失缺失（I/DI/D）多态性多态性片段，片段，I/DI/D多态性与血液多态性与血液ACEACE水平有明水平有明确关系，确关系，DDDD型型ACEACE水平最高，水平最高，IDID次之，次之，IIII最低。左室肥大患最低。左室肥大患者中者中DDDD型频率明显增高。型频率明显增高。实验原理实验原理 以以D
3、NADNA为模板，为模板，ACEACE基因特异的引物序列位于基因特异的引物序列位于287bp287bp插入插入/缺失缺失片段的两侧进行片段的两侧进行PCRPCR扩增，故扩增，故IIII型扩增片段长度约为型扩增片段长度约为490bp490bp，DDDD型扩增片段长度约为型扩增片段长度约为190bp190bp，IDID型扩增片段为个，分别型扩增片段为个，分别为为190bp190bp和和490bp490bp。根据。根据PCRPCR扩增片段的大小可进行多态性分扩增片段的大小可进行多态性分析。析。插入片段插入片段插入型插入型缺失型缺失型490bp190bp 基因组基因组DNADNA抽提抽提 PCRPCR
4、反应反应 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测 溶液溶液 10 ml 10 ml 漱口漱口2020秒秒 收集漱口水；收集漱口水；3000g3000g5min5minRTRT，弃上清；，弃上清；溶液溶液 250 ul 250 ul 重悬沉淀；重悬沉淀；3000g3000g1min1min，弃上清；，弃上清；溶液溶液 250 ul 250 ul 重悬沉淀，振荡重悬沉淀，振荡1010秒；（秒；（变性变性）转至转至0.5 ml0.5 ml离心管，离心管，99995min5min；加溶液加溶液IV 50 ul IV 50 ul 振荡振荡5 5秒；（秒；（中和中和）3000g3000g1min1min，上
5、清转移至新上清转移至新0.5 ml0.5 ml离心管，取离心管，取5 ul5 ul用于用于PCR.PCR.取消毒的取消毒的0.5 ml0.5 ml离心管，加入下列成分：离心管，加入下列成分：1010PCR BufferPCR Buffer dNTP(2.5 mM each)dNTP(2.5 mM each)mix:10l10l Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase DNADNA模板模板 5 l5 l 引物混合物引物混合物(10M each)2 l(10M each)2 l ddH ddH2 2O 3 lO 3 l 总体系总体系 20 l20 l 扩增程序为：扩增程序为：9494变性变性30s30s，5555复性复性30s30s，7272延伸延伸40s40s，共反应，共反应3535个个循环。循环。制备制备1 1琼脂糖凝琼脂糖凝 点样，电泳点样，电泳 紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果2k1k750bp500bp250bp100bp14 结束语结束语
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