实验四复方丹参中丹参素的药物动力学研究gbkt

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1、大鼠灌服服复方丹丹参方后后血清中中丹参素素的测定定潘桂湘 基金项目：国家重点基础研究规划项目(G199944054403) 作者简介：潘桂湘(1976-)，男，硕士，研究方向为药物分析。Tel：022-23051076 Email：guixiangp，张张伯礼，高高秀梅（天津中中医学院院中医药药研究中中心，天天津30001993）摘要目的：了了解大鼠鼠ig复复方丹参参方后水水溶性成成分的吸吸收情况况，建立立大鼠血血清中丹丹参素的的含量测测定方法法。方法法：采用用液液萃萃取法对对血清样样品进行行预处理理，以对对羟基苯苯甲酸为为内标，甲甲醇-乙乙腈-00.5%醋酸（22.5：3.55：944）为流

2、流动相，用用高效液液相色谱谱法于2281nnm检测测。结果果：大鼠鼠ig复复方丹参参方后在在血清中中检测到到丹参素素，用所所建立的的方法绘绘制了其其经时血血药浓度度曲线；而原儿儿茶醛则则未在血血清中发发现，检检测到的的是一个个保留时时间稍前前于原儿儿茶醛的的未知化化合物。结论：大鼠灌服复方丹参方后，丹参素可经胃肠道吸收入血，呈快吸收慢消除的过程。关键词词 复方丹丹参方；丹参素素；高效效液相色色谱法；体内药药物分析析复方丹参参方由丹丹参、三三七及冰冰片组成成，具有有活血化化瘀，理理气止痛痛之功效效，是临临床治疗疗冠心病病、胸闷闷、心绞绞痛的常常用中药药处方。方方中的化化学成分分根据其其理化性性质

3、和药药理作用用的差异异，可将将之分为为丹参水水溶性成成分、丹丹参脂溶溶性成分分和三七七皂苷类类成分三三大类。丹丹参水溶溶性成分分含有多多种酚酸酸类化合合物，该该类成分分具有很很强的抗抗脂质过过氧化、抗抗血栓等等作用1，可可能是复复方丹参参方中的的主要活活性部位位。传统中药药多为口口服制剂剂，其有有效物质质往往以以血液为为介质而而输送到到靶点产产生作用用。就此此而言，给给药后的的血清才才是真正正起作用用的“粗的药药物”2。所以以，中药药的药效效物质基基础应该该在给药药后的血血清组成成中进行行探讨3。虽虽然近年年来国内内对复方方丹参方方的研究究较多，但但对该方方药效物物质基础础进行深深入探讨讨的研

4、究究则相对对很少。通通过研究究复方丹丹参方动动物给药药后血清清中的成成分及其其相应的的药理作作用，则则可以更更直接地地了解到到复方中中真正起起作用的的化学物物质基础础。所以以本文对对大鼠灌灌服复方方丹参方方后丹参参水溶性性成分的的吸收状状况进行行了研究究，并建建立了血血清中丹丹参素的的HPLLC测定定方法，为为进一步步阐明其其药效物物质基础础提供科科学的依依据。1 材料料与方法法1.1 材料仪器 HP111000高效液液相色谱谱仪，GG13111A-四元泵泵，G113222A-脱脱气机，GG13116A-柱温箱箱，13314AA-UVV可变波波长检测测器，HHPReev.AA.05501化化学

5、工作作站。试药 甲醇、乙乙腈为色色谱纯，水水为超纯纯水，冰冰醋酸、乙乙酸乙酯酯为分析析纯，丹丹参素、原原儿茶醛醛对照品品（中国国药品生生物制品品检定所所），对对羟基苯苯甲酸（化化学纯），三三氯醋酸酸（分析析纯），复复方丹参参方药液液（取丹丹参和三三七提取取物适量量，加蒸蒸馏水配配制成生生药量比比为100：6的药药液）。动物 SD大大鼠，雌雌雄各半半，体重重(200010)g，北北京维通通利华实实验动物物中心提提供。1.2 色谱条条件Hypeersiil CC18（55m）44.6mmm2500mm色色谱柱，甲甲醇-乙乙腈-00.5%醋酸（22.5：3.55：94）为为流动相相，流速速为1.0m

6、LLminn-1，检检测波长长为2881nmm，色谱谱图见图图1。1.3 样品的的处理与与测定 精密密量取血血清样品品1.00mL，加加入1%醋酸550L，内内标溶液液50L，110%三三氯醋酸酸溶液2200L，用用涡旋混混合器混混旋1mmin，1120000rminn-1离心心10mmin。将将上清液液转移至至具塞尖尖底离心心试管中中，用44mL乙乙酸乙酯酯旋涡混混合提取取1miin，330000 rminn-1离心心2miin，分分取有机机层，于于45水浴上上通N22流挥干。临临用前残残渣用甲甲醇500L溶解解，超声声1miin，旋旋涡混合合1miin，离离心（1120000 rrminn

7、-1）110miin，取取上清液液10L进样样，以内内标工作作曲线法法4求算丹丹参素的的血药浓浓度。1.4 标准曲曲线的绘绘制1.4.1 标标准贮备备液配制制 精精密称取取4.00mg丹丹参素于于10mmL容量量瓶中，用用1%醋醋酸定容容至刻度度，然后后取适量量用1%醋酸稀稀释成浓浓度为00.0116，00.044，0.08，00.166，0.24，00.8mmgmL-11的丹参参素标准准溶液。另另精密称称取4.1mgg对羟基基苯甲酸酸于100mL容容量瓶中中，用11%醋酸酸稀释至至刻度，再再取1mmL稀释释至100mL作作为内标标溶液。1.4.2 标标准曲线线的制备备 精精密量取取空白血血清

8、样品品1.00mL，加加入不同同浓度的的丹参素素标准溶溶液500L，内内标溶液液对羟基基苯甲酸酸50L，110%三三氯醋酸酸溶液2200L，按按“1.3样品品的处理理与测定定”方法进进行处理理与测定定。以丹丹参素与与内标物物的峰面面积比值值（Y）为为纵坐标标，丹参参素浓度度（X）为为横坐标标，用最最小二乘乘法进行行线性回回归。1.5 给药方方案与样样品采集集 SSD大鼠鼠随机分分组，每每组3只只（即每每个取样样时间点点3只），实实验前112h禁禁食，不不禁水。除除空白组组大鼠外外，各组组大鼠按按2.55mL1000g-11剂量灌灌服复方方丹参方方药液。大大鼠于灌灌服前和和灌服后后15，330，

9、445，660，775，990，1120，1180，2240，3360mmin心心脏采血血，377水浴温温孵后，离离心100minn（30000 rminn-1），分分离血清清。2结果2.1 丹参素素经时血血药浓度度测定结结果 取血清样样品1.0 mmL，按按“1.33样品的的处理与与测定”进行操操作，得得大鼠iig复方方丹参方方药液后后丹参素素的经时时血药浓浓度，结结果见表表1。表1 丹参参素经时时血药浓浓度（nn=3）取血点取血时间间miin 153045607590120180240360血药浓度度gmL-11703.6599.7187.2183.7122.5128.565.9939.4

10、444.8826.772.2 精密度度试验 取空空白血清清1.00mL，加加入不同同浓度的的丹参素素标准溶溶液制成成高、中中、低33种不同同浓度样样品，按按与血清清样品相相同的处处理方法法进行处处理，测测定日内内精密度度和日间间精密度度，结果果见表22。表2 丹参参素血药药浓度测测定方法法的精密密度考察察（n=5）加入量/gmL-11RSD/%日内精密密度日间精密密度401.43.01603.14.38004.25.62.3 线性关关系 按“标准曲曲线的制制备”方法测测得丹参参素与内内标物的的峰面积积比值（YY）与丹丹参素浓浓度在1168800gmL-11范围内内线性关关系良好好，回归归方程为

11、为Y = 5.1766X+00.1118，rr = 0.999900。2.4 回收率率试验 试验验方法同同精密度度，按测测得量与与加入量量求算方方法的回回收率，结结果见表表3。表3 丹参参素血药药浓度测测定方法法的回收收率考察察（n=5）加入量/gmL-11测得量/gmL-11回收率/%RSD/%平均回收收率/%353497.112.197.7712011797.553.480078998.664.32.5 最小检检测限 将适适量丹参参素溶液液加入到到空白血血清中，按按“1.33样品的的处理与与测定”进行操操作，进进样，以以S/NN10为为定量限限，S/N3为检检测限，测测得丹参参素最低低定量

12、浓浓度为00.155gmL-11，最小小检测浓浓度为00.055gmL-11。3 讨论论3.1在在进行样样品预处处理过程程中，曾曾比较了了液-液液萃取与与液固萃萃取的回回收率情情况。结结果显示示液固萃萃取的萃萃取回收收率要低低于液液液萃取。其其原因可可能在于于丹参素素属弱酸酸性成分分，虽调调节了溶溶液的PPH值，但但它在CC18固相相萃取小小柱上的的吸附仍仍然不完完全，且且其极性性较大，可可能在洗洗脱除杂杂过程中中有部分分的损失失。3.2血血清样品品先用三三氯醋酸酸处理，然然后再进进行液液液萃取操操作，这这两步处处理一方方面可以以使蛋白白去除更更为完全全，另一一方面又又调节了了溶液的的PH，使

13、使复方丹丹参方中中丹酚酸酸类成分分处于游游离状态态，有利利于提取取的完全全。3.3 大鼠灌灌服复方方丹参方方后丹参参素的经经时血药药浓度呈呈现快吸吸收慢消消除的特特点：给给药155分钟即即达到血血药浓度度峰值，表表明丹参参素在大大鼠体内内能够迅迅速吸收收，起到到速效的的作用。随随后在116个小小时丹参参素缓慢慢消除，可可能是丹丹参素分分布到组组织后停停留的时时间较长长造成，也也可能是是复方中中其它丹丹参酚酸酸类成分分在胃肠肠道或肝肝脏中代代谢转化化成丹参参素所致致。3.4 由色谱谱图1可可见tRR=199minn左右处处有一色色谱峰，其其保留时时间稍小小于原儿儿茶醛的的tR值，且且该峰的的峰值

14、随随给药时时间的不不同呈不不规则的的变化。由由于代谢谢物一般般较原形形药物极极性增大大，在用用反相柱柱进行分分析时保保留时间间提前，因因而提示示该峰有有可能为为原儿茶茶醛或其其它酚酸酸类成分分的代谢谢产物，具具体还有有待于实实验的进进一步证证实。参考文文献1 黎莲娘，张张均田.丹参及及其同属属植物的的水溶性性活性成成分.医医药研究究通讯，220011，300（7）：2.2 贺玉琢.日本汉汉方药“血清药药理学”、“血清药药化学”的研究究概况.国外医医学中医中中药分册册，19998，220（55）：33.3 张礼和.我对中中药复方方有效成成分研究究的一些些看法.化学进进展，119999，111（2

15、）：1866.4 曾经泽.生物药药物分析析.北京京：北京京医科大大学协和和医科大大学联合合出版社社，19998.Deteermiinattionn off Daanshhenssuinn Raat SSeruumafteerOrall Addminnistter Commpouund Sallviaa ReecippePAN Guii-xiaang,ZHANNG BBo-li, GAAOXiu-meii(Tiaanjiin CColllegee off Trradiitioonall Chhineese Meddiciine, Tiianjjin 30001933)AbsstraactObbj

16、ecctivve: To invvesttigaate thee abbsorrptiion of thee waaterr soolubble commponnentts oof SSalvvia milltioorrhhizaa annd eestaabliish metthodds tto ddeteermiine Dannsheensuu inn raat sseruum aafteer iig ccomppounnd SSalvvia reccipee. Meethood:Useed lliquuid-liqquidd exxtraactiion to deaal wwithh th

17、he sseruum, theen ddeteermiinedd thhe ssampple by higgh-pperfformmancce lliquuid chrromaatoggrapphy. Thhe ccondditiionss foor HHPLCC weere as thee foolloowinng: thee moobille pphasse, CH33OH- CHH3CN-0.55%CHH3COOH (2.55:3.5:944) wwithh a floow rratee off 1.0 mmLminn-1; dettecttionn waavellenggth, 288

18、1nmm; iinteernaal sstanndarrd, 4-hhydrroxyy-beenzooic aciid. Ressultt: DDansshennsu andd ann unnknoown commpouund whoose resservved timme wwas litttlee shhortter thaan pprottocaatecchuiic aaldeehydde wweree fooundd inn thhe rrat serrum aftter ig commpouund Sallviaa reecippe, whiile prootoccateechuui

19、c alddehyyde werrent ffounnd iin tthe serrum Conncluusioon:Dannsheensuu caan bbe aabsoorbeed iintoo blloodd affterr igg coompooundd Salvvia reccipee.Keyy Woordss：Commpouund Sallviaa Reecippe；DDansshennsu；HPLLC；BBioppharrmacceutticaal AAnallysiis8At/miinBt/miinCt/miin图1大鼠鼠灌服复复方丹参参方后血血清样品品的色谱谱图A. 含含对照品品的血清清样品 BB. 空空白血清清样品 CC. 含含药血清清样品1. 丹丹参素 22. 原原儿茶醛醛 3. 对羟基基苯甲酸酸 4. 未知物物图2 大鼠鼠灌服复复方丹参参方后丹丹参素的的经时血血药浓度度曲线10