秀丽隐杆线虫

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1、分类号 编号烟 台 大 学毕 业 论 文利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质Screening anti-Candida albicans substances using Caenorhabditis elegans利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质摘要：以秀丽隐杆线虫作为模型生物进行抗菌物质筛选。用白色念珠菌感染线虫后，采用不同浓度的已知抗菌药物治疗,观察线虫存活情况,确定合适用药浓度;采用微拟球藻提取物对白色念珠菌感染线虫治疗，观察线虫存活情况，与已知抗菌药物作用效果对比，从而筛选出可用于治疗白色念珠菌活性物质。实验发现，添加1020mg/L的氟康唑对感染白色念珠菌的秀丽隐杆线

2、虫治疗效果较好,在一定剂量范围内,治疗效果和剂量成线性关联;微拟球藻提取物不具备抗菌活性.关键词：秀丽隐杆线虫；白色念珠菌;抗菌物质Abstract： In the study， Caenorhabditis elegans were used as model organism to screen antibacterial agents。 C.elegans were infected by Candida albicans and treated by different concentrations of antibacterial agents which had been know

3、n and extracts from Nannochloropsis OZ1, observating the survival situation and comparing the effects of the two antibacterial agents, thus， the bioactive substance could be screened which cured the Candida albicans。 The result showed that Candida albicans could be treated by 1020 mg/L Fluconazole,

4、moreover within the scope of the dose， treatment effect and the dose of a linear correlation. And the results showed that extracts from Nannochloropsis OZ1 did not have antibacterial activity。Key words： C。elegans；Candida albicans；Antibacterial substances目录1 文献综述11.1 秀丽隐杆线虫11.2 秀丽隐杆线虫研究进展11。2。1 环境毒理学

5、的研究21.2。2 程序性细胞死亡的研究21.2。3 秀丽隐杆线虫感染模型的建立21.2.4 抗菌物质作用机制的研究21。2.5 病菌致病机制和线虫免疫机制的研究31.3 白色念珠菌31.4 抗菌物质的筛选41.5 实验研究意义52 材料和方法62.1 材料62.1.1 实验药品62。1。2 实验仪器62。1.3 线虫和菌株72.1。4 培养基72.1。5 试剂72.2 方法72.2.1 线虫培养和保存72.2.2 线虫同步化82.2。3 线虫真菌感染82。2。4 线虫抗感染治疗82。2。5 观察83 实验结果分析93。1 氟康唑用药浓度的选择93.2 筛选可用于治疗白色念珠菌的微拟球藻提取物

6、94 结论12致谢13参考文献141 文献综述1。1 秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫1（Caenorhabditis elegans）（图1)是一种多细胞真核生物，个体很小,以细菌为食,可独立生存在温度恒定环境中,对人、动植物没有危害。成虫1 mm左右，通体透明，在普通显微镜下可观察。秀丽隐杆线虫有很少的雄性个体，大多数为雌雄同体。秀丽隐杆线虫生命周期很短，从卵到成虫需要3。5 d，平均寿命约为23周2。雌雄同体个体产卵孵化后，会经历四个幼虫期（L1L4），L4期生有精子，并在成虫期产卵。雄性也能使雌雄同体受精,且雌雄同体优先选择雄性的精子.当族群拥挤或食物不足时，秀丽隐杆线虫会进入dauer幼虫期

7、,dauer能对抗逆环境，而且不会老化。秀丽隐杆线虫基因组测序完成，是第一个完成的多细胞动物基因序列测定的动物，它的基因组序列40以上与人类同源。秀丽隐杆线虫有5对常染色体和1对性染色体，其遗传背景清晰.图1 秀丽隐杆线虫Fig。1 Caenorhabditis elegans1。2 秀丽隐杆线虫研究进展秀丽隐杆线虫最开始被用于研究发育生物学和神经生物学，随科学技术发展，对秀丽隐杆线虫的广泛研究,人们发现了调节器官发育及细胞程序性死亡的关键性的基因,也证明了这些基因同样存在于高等动物中。这些研究开辟了研究人体细胞的分化及演变的道路，有利于研究很多疾病的发病机制。Brenner1选取了秀丽隐杆线

8、虫线虫作为生物模型，开启了一个崭新的领域.秀丽隐杆线虫具有结构简单、生命周期短、基因测序完成等优点，使其作为一种模型生物得到广泛应用。秀丽隐杆线虫作为优秀的模型生物不仅用于抗菌药物的体内研究，还被广泛应用于毒理学、基因组学、环境生物学、人类疾病模型的复制和干预.1。2。1 环境毒理学的研究随着环境污染的严重，线虫开始运用于环境毒理学的研究，环境中的重金属、电辐射等毒素对人类的健康状况产生严重的威胁，线虫可以用来研究它们的作用机制,评估其危害性。线虫模型如果能模拟毒素的作用机制，那么线虫将更加广泛的用于环境毒理学的研究3。1。2.2 程序性细胞死亡的研究秀丽隐杆线虫为程序性细胞死亡研究奠定了基础

9、。Horvitz等4在秀丽隐杆线虫身上发现了基因调控的程序性细胞死亡的存在,他们发现了两个基因ced3和ced-4，认为它们是发生细胞死亡的前提。后来，他们又发现了ced9与ced-3和ced-4相互作用来阻止细胞死亡。对于程序性的细胞死亡的认识，使我们对一些疾病的发病机制有了新的理解，调控程序性的细胞死亡的功能性缺陷导致的疾病大体分为两种,一种是由细胞病理性丢失过多，另一种是清除有害细胞的机能受损。对疾病本身的认识的加强为疾病的治疗提供了思路,科学家现在已经开始利用程序性细胞死亡的机理来研究治疗恶性肿瘤的新办法5。1.2.3 秀丽隐杆线虫感染模型的建立研究细菌致病机制是用线虫模型研发抗菌药物

10、的基础。线虫是一种简单的模型生物,可以被很多病菌感染。周雨蒙等6建立了线虫耐药铜绿假单胞菌感染模型，在用抗生素治疗线虫的实验中发现，可以排除毒性高、体内外相关性差的化合物,此模型为筛选得到具有良好体内效果的新型抗菌化合物或生物活性物质打下了基础.陈丽红等7建立了铜绿假单胞菌线虫感染模型，确立了合适的铜绿假单胞菌培养时间和线虫的感染时间，并研究了多种抗生素对线虫的存活时间的影响，可以用于未知物质用量相当于等状态下抗生素用量的计算.1。2。4 抗菌物质作用机制的研究细菌的毒力的减弱是研发抗菌物质的一个靶点,Ho等8通过感染秀丽隐杆线虫研究发现，雷洛昔芬可以强烈的抑制铜绿假单胞菌的毒力的产生.实验使

11、用此药物对野生型铜绿假单胞菌进行治疗，结果发现细菌产生的绿脓菌素水平明显下降。这些结果表明雷洛昔芬可能会被用于开发新型的疗法以此来靶向治疗铜绿假单胞菌的感染。现在关于铜绿假单胞菌中的拮抗细菌群体感应系统的研究是一大热点。以抑制QS系统为靶标的分子抑制物，可用于研发新的抗菌物质。Sarabhai等9利用秀丽隐杆线虫模型实验发现诃子的果实中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系统，阻断了细菌细胞间的信号传递作用。它的机制是，减少了QS系统中两个重要的基因的表达，同时减弱了革兰氏阴性菌的信号分子AHL的表达，最后减弱了野生型铜绿假单胞菌的毒力并增加了它的生物膜对妥布霉素的敏感性.1.2.5 病菌致病机制和线虫

12、免疫机制的研究不同的病菌对线虫的的致病机制并不一样，线虫自身也具有免疫机制。目前发现，可以感染线虫的病菌都是通过生理途径进行感染的。Irazoqui等10研究了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染线虫的致病机制。铜绿假单胞菌侵占线虫肠道,产生与毒力因子有关的囊泡，在肠道细胞累积高电子密度生物被膜样物质，使肠道细胞变异。而金黄色葡萄球菌迅速感染细胞，破坏肠道绒毛，溶解线虫细胞.金黄色葡萄球菌经过热灭后仍可以感染线虫，这是因为其可以分泌有溶血活性的热毒力因子.McEwan等11研究出铜绿假单胞菌会引起秀丽隐杆线虫肠道的天然免疫力。线虫没有专门免疫细胞，线虫肠道上皮细胞充当防御系统，当铜绿假单胞菌积累在

13、线虫肠道处,会增加线虫的机体损伤或抗微生物相关基因的表达量。ToxA（外毒素A）是铜绿假单胞菌所表达的一种细菌毒素，线虫感染了铜绿假单胞菌后，ToxA可以抑制线虫体内蛋白质的合成,线虫通过识别ToxA激活体内免疫基因的表达来抵抗铜绿假单胞菌的感染.1.3 白色念珠菌白色念珠菌(Candida albicans)(图2)又称白假丝酵母菌，是一种真菌,广泛的存在于自然界，也存在于人体的口腔、上呼吸道等地，在正常机体中一般数量较少，不会引起疾病，是一种条件致病菌.白色念珠菌细胞呈圆形或卵圆形，直径36 um，革兰染色为阳性，出芽方式繁殖，真菌细胞出芽生成假菌丝，假菌丝长短不一，假菌丝收缩断裂又成为芽

14、生的菌丝.在适宜的培养基上芽生孢子及假菌丝生长，在假菌丝间其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌在沙保氏培养基上呈乳白色偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍长后则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有褶皱。白色念珠菌感染和致病机制有附着、发芽、蛋白酶、菌落转换，可以侵犯人体许多部位，如皮肤、黏膜等,会引起皮肤念珠菌病、黏膜念珠菌病、内脏念珠菌病。最早用于治疗酵母菌感染的特异性活性药物是多霉菌素，它是上世纪中期分离的一种聚烯类抗生素，此后又有很多抗真菌药物被研发出来,氟康唑是一种常用的抗白色念珠菌药物，抗菌谱较广,其机制主要为高度选择性干扰真菌的细胞色素P450的活性，从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生

15、物合成,达到抑菌效果。 图2 白色念珠菌Fig. 2 Candida albicans 1.4 抗菌物质的筛选抗生素的广泛应用，使越来越多的病菌具有了耐药性，而新型的抗菌药物的发现时间变的更长，新型的抗菌物质的研发进入了瓶颈，开发新型的抗菌物质成为一个非常重要的任务。体外抗菌实验方法简单，但存在一些问题，为走出这种困境可以通过活体生物感染模型来解决。传统的动物模型耗时长、耗费高、操作复杂，具有很多缺点，而线虫具有结构简单、生命周期短、易于培养等优点,另外其基因组序列40%以上与人类同源,许多基因和生物机制方面的高保守性,使线虫成为体内药物筛选的优秀模型。它可避免小白鼠模型的高成本、时间长的缺点

16、，又可以提供相对完整的动物实验模型，因此可以很大程度降低药物筛选的成本，适用于大规模的药物筛选12。Moy等13建立了粪肠球菌感染的秀丽隐杆线虫体内抗感染物质筛选模型。他们在96孔板上进行筛选，筛选了1000多种天然产物还有6000余种合成化合物，筛选发现9种提取物和16种化合物可以使被粪肠球菌感染的线虫的寿命延长。他们虽然利用线虫活体筛选抗菌物质的实验方法很先进，但是也有很多缺点，有很多人工操作需要重复进行，还需要通过显微镜观=观察判断线虫死亡状况，比较耗费人力和时间.随后，他们对实验方法进行改进，建立了全自动化和更微型化的384孔板采集分析的高通量筛选系统。他们采用这个系统筛选了37000

17、个天然提取物和化合物，发现了28种没有被报道过的具有抗菌活性的物质14.Okoli等15建立了线虫白色念珠菌感染模型的高通量筛选抗真菌物质的系统。他们用这个系统筛选了1900多种生物活性化合物和1280余种小分子合成化合物，筛选出了19种化合物具有抗真菌活性。Breger等16建立了白色念珠菌秀丽隐杆线虫感染模型，筛选了1200余种已知药理活性的化合物,他们发现了15个化合物能延长被感染的秀丽隐杆线虫的寿命，而且可以抑制白色念珠菌在秀丽隐杆线虫体内形成假菌丝。用白色念珠菌秀丽隐杆线虫模型筛选发现的抗真菌药物在结构上和现在的抗真菌药物不具有相似性，可能存在不同作用机制，这为发现新型的复合型抗真菌

18、药物指明了方向。杨再昌等17采用金黄色葡萄球菌秀丽隐杆线虫感染模型、铜绿假单胞菌-秀丽隐杆线虫感染模型,筛选了43种中草药的体内抗菌疗效，发现8种中草药具有体内抗菌作用。对9种提取物进行体外抗菌实验，发现在1600 ug/ml时，除黄连外，其余8种提取物无抗菌活性,但是浓度低于1600 ug/ml时对线虫产生保护作用。利用秀丽隐杆线虫感染模型进行抗感染物质筛选具有体外筛选不具备优势，它可以发现体外没有抗菌活性但体内有活性的物质，以及一些新型抗感染机制的化合物，还可以筛选去除有毒化合物和体内无效的化合物18.1。5 实验研究意义秀丽隐杆线虫作为一种模型生物为筛选抗菌物质提供了良好的平台,为新型抗

19、菌物质的研发提供了一个良好的工具，在研发新型抗菌药的过程中诸多问题也可以通过对感染的活体动物模型研究来解决.因此，利用秀丽隐杆线虫模型进行抗感染药物筛选具有重要意义19。虽然线虫与人类基因有高度的保守性，作为模型生物在抗菌物质体内研究中表现出很大优势，然而，线虫与人类在生理等方面还是有很大差异,线虫不能在37下存活,线虫不具备免疫系统，所以还需要进行其他的哺乳动物模型进行抗菌物质筛选。线虫还具有很强的解毒系统,这是因为细胞色素P450基因的原因，因此这就限制了一些可以调节宿主防御的化合物的发现。目前,秀丽隐杆线虫只能用于初选抗感染药物，新药物的研发还需要后续的动物试验和临床试验。我们应该正确认

20、识秀丽隐杆线虫在抗菌物质筛选研究中的优势和缺点，然后设计合理周密的实验方案，确保线虫模型和人类疾病的某些一致性，只有这样才能发挥线虫模型这个体内抗感染药物筛选和体外抗感染研究桥梁的作用20。本论文利用秀丽隐杆线虫来筛选抗白色念珠菌的活性物质，选取了常用抗真菌药物氟康唑进行抗感染治疗，验证了秀丽隐杆线虫模型的可行性。另选取了微拟球藻提取物,对线虫进行抗感染治疗,以此来探究微拟球藻提取物是否具有抗菌疗效。2 材料和方法2.1 材料2.1。1 实验药品表1 实验药品Table 1 List of experimental regents试剂名称纯度级别生产厂家蛋白胨-上海东海制药厂氯化钠AR天津市永

21、大化学试剂有限公司琼脂-北京康倍斯科技有限公司胆固醇-北京奥博星生物技术有限责任公司磷酸氢二钾AR天津市瑞金特化学品有限公司磷酸二氢钾AR天津市瑞金特化学品有限公司硫酸镁AR天津市瑞金特化学品有限公司氯化钙AR天津市瑞金特化学品有限公司磷酸氢二纳AR天津市永大化学试剂有限公司葡萄糖AR天津市瑞金特化学品有限公司酵母浸粉北京奥博星生物技术有限责任公司胰蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司乙醇（95)AR天津市永大化学试剂有限公司氢氧化钠AR天津市永大化学试剂有限公司次氯酸钠AR天津市富宇精细化工有限公司酵母浸粉2。1。2 实验仪器表2 实验仪器与生产厂家Table 2 List of exper

22、imental instruments仪器名称型号生产厂家精密天平BSM-220.3上海卓精电子科技有限公司立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-75S11上海博迅实业有限公司医疗设备厂单人单面净化工作台SWCJ1FD苏州净化设备有限公司台式高速离心机TGL-16江苏省金坛市医疗仪器厂振荡培养箱BS1E（A）东联电子技术开发有限公司2。1。3 线虫和菌株 N2野生型秀丽隐杆线虫（购自CGC）、尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50(购自CGC）、白色念珠菌（滨州医学院惠赠）。2。1.4 培养基NGM培养基 1000 ml的培养基加入2.5 g蛋白胨，3 g NaCl，17 g琼脂,975 ml蒸馏水，灭菌后分

23、别加入单独灭菌的l mol/L K2HPO4 - KH2PO4缓冲液(pH6.0）25 ml，1 mol/L MgSO4 1 ml，1 mol/L CaCl2 1 ml,1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml），用于线虫培养。LB培养基 1000 ml培养基含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 2。5 g,琼脂17 g，用于大肠杆菌OP50培养。沙保氏培养基 1000 ml培养基中含40 g葡萄糖和10 g蛋白胨,pH 4.06.0，用于真菌培养.YPD液体培养基 900 ml蒸馏水中含10 g酵母提取物和20 g蛋白胨，100 ml蒸馏水中含20 g葡萄糖，分开灭菌，灭菌后合并，用于

24、液体培养白色念珠菌。2。1。5 试剂M9缓冲液 1000 ml的M9缓冲液含6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0。25 g MgSO4。7H2O，现用现配.线虫裂解液 每5 ml含有3.4 ml蒸馏水，0。6 ml NaClO，1 ml 8 mol/L NaOH，现用现配。2.2 方法2。2.1 线虫培养和保存秀丽隐杆线虫培养时选用大肠杆菌OP50作为其食物，在NGM培养基上生长培养.挑取大肠杆菌OP50单菌落于 LB液体培养基中，37 过夜振荡培养,制成菌悬液。吸取少量菌悬液涂布到NGM平板,培养24h。用M9缓冲液清洗线虫，静置后去掉上清液，沉淀物接种到NGM

25、培养基上，放于20 的恒温培养箱中培养3天，可看到培养基上有大量线虫21。实验室中可将线虫放入30 %甘油中，在80 下保存22.2.2.2 线虫同步化 选用生长状态良好的平板，用M9缓冲液将虫体洗于玻璃管中，等虫体沉降后吸去上清液，加入线虫裂解液，旋涡震荡5 min至虫体裂解，将其转移至离心管中800 r/min离心1 min，吸去上清液，加入M9缓冲液,重复离心2次，吸去上清液，得到虫卵,将其放入新的NGM平板的大肠杆菌OP50菌苔上,20 生长2天,得到同步化的L4时期线虫.2。2.3 线虫真菌感染 选取白色念珠菌单菌落于50 ml的YPD液体培养基中，30 ，振荡培养24 h，吸取80

26、 ul菌液于沙保氏平板，涂布,30 培养24 h，得到白色念珠菌感染平板。将同步化的L4时期线虫从大肠杆菌OP50菌苔用M9缓冲液洗下,将其转移至沙保氏平板生长的白色念珠菌菌苔上进行感染，培养10 min。2.2。4 线虫抗感染治疗 将经过感染的线虫从白色念珠菌菌苔上洗下，M9缓冲液清洗后，加入M9缓冲液,转移至96孔板中培养,每个孔中加入300ul含有线虫的M9缓冲液。第一列孔为阴性对照，不加入任何物质，其后各孔加入不同剂量的药物,使各孔中的药物浓度有所差异,对线虫进行抗菌治疗。每次实验做3组平行。 另取一经过白色念珠菌感染线虫,将其用M9缓冲液洗下，加入M9缓冲液，转移至96孔板中培养。第

27、一列孔为阴性对照,不加入任何物质，其后各孔加入不同剂量的微拟球藻提取物，对线虫进行抗菌治疗。每次实验做3组平行.2。2.5 观察 将96孔板置于显微镜观察，活线虫呈正弦状(图3a），而死亡线虫呈直线型（图3b），记录存活的线虫数量。每个孔的线虫的存活率单独计算，然后取三个孔的的平均值. a。 线虫存活状态 b. 线虫死亡状态图3 秀丽隐杆线虫感染前后状态Fig。 3 Different status of C。elegans before and after bacterial infection 3 实验结果分析3。1 氟康唑治疗效果实验选用临床常用的抗真菌药物氟康唑对感染白色念珠菌10 m

28、in的线虫进行治疗.根据氟康唑药品使用说明，人体的正常用药血液中含量为45 mg/L60 mg/L。本实验初步选用药物浓度为2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，连续观察记录线虫存活情况，直到第六天对照组死亡，结果如图4所示.图4 不同浓度的氟康唑对感染线虫的疗效Fig。4 Effect of different concentrations of fluconazole on infection elegans 由图4可知,不同浓度的氟康唑对感染白色念珠菌的线虫疗效不同.浓度较低时,治疗效果相对较差，随着氟康唑浓度的增加，治疗效果越好,但并不是浓度越

29、高越好，浓度过高对线虫产生一定的毒副作用,会导致线虫死亡.线虫感染白色念珠菌10 min以后，添加1020 mg/L的氟康唑治疗效果比较好，在一定剂量范围内,治疗效果与剂量成线性关联。3.2 筛选可用于治疗白色念珠菌的微拟球藻提取物用95%乙醇浸提微拟球藻浸粉,得到乙醇浸膏，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到3种萃取相和水相，用得到的正丁醇萃取相上大孔树脂D101，分别用40、60、80乙醇洗脱得到洗脱液。本次实验用的微拟球藻提取物为水相提取物和正丁醇相40、60%、80%乙醇洗脱液.采用40乙醇洗脱液进行抗菌治疗，分别加入5ul、10ul、20ul剂量进行治疗，连续观察记录线虫存活状况

30、，直到线虫死亡，结果如图5所示.图5 40%乙醇洗脱液对感染线虫的疗效Fig。 5 Effect of the 40 ethanol eluent on infection elegans 采用60乙醇洗脱液进行抗菌治疗，分别加入5ul、10ul、20ul剂量进行治疗，连续观察记录线虫存活状况，直到线虫死亡,结果如图6所示.图6 60 乙醇洗脱液对感染线虫的疗效Fig。 6 Effect of the 60 ethanol eluent on infection elegans采用80乙醇洗脱液进行抗菌治疗，分别加入5ul、10ul、20ul剂量进行治疗，连续观察记录线虫存活状况，直到线虫死亡

31、,结果如图7所示.图7 80乙醇洗脱液对感染线虫的疗效Fig.7 Effect of the 80% ethanol eluent on infection elegans乙醇洗脱液中含有一定量的乙醇，可能会对实验有一定影响，因此用乙醇做一组对照实验，观察线虫存活情况，发现对线虫存活无明显影响，因此可以排除乙醇对实验的影响。采用水相提取物进行抗菌治疗，分别加入2.5ul、5ul、10ul、20ul剂量进行治疗，连续观察记录线虫存活状况，直到线虫死亡，结果如图8所示。图8 水相提取物对感染线虫的疗效Fig。8 Effect of the aqueous extract on infection

32、elegans由以上4个图可知，微拟球藻的正丁醇萃取相40%、60%、80乙醇洗脱液，与对照组相比较不具有抗菌疗效;水相提取物与对照组相比,同样不具有抗菌效果,加入量过多还会引起线虫死亡。4 结论氟康唑是一种常用的抗白色念珠菌药物,抗菌谱较广，其机制主要为高度选择性干扰真菌的细胞色素P450的活性，从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成，达到抑菌效果.本次实验分别选用氟康唑和微拟球藻提取物对感染了白色念珠菌的秀丽隐杆线虫进行治疗。选用氟康唑对感染线虫进行治疗,在一定剂量范围内，治疗效果与剂量呈线性关系，添加1020 mg/L的氟康唑治疗效果较好。选用微拟球藻提取物对感染线虫进行治疗，发现不具备

33、抗菌疗效。致谢参考文献1 Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegansJ. Genetics， 1974, 77: 7194。 2 赵晴, 蒋湉湉. 秀丽隐杆线虫研究综述J. 安徽农业科学, 2010， 38(19）： 1009210095.3 贾熙华， 曹诚。 秀丽隐杆线虫在医药学领域的应用和进展J. 药学学报， 2009， 44(7)： 687694 .4 Ellis HM, Horvitz HR。 Genetic control of programmed cell death in the nematode C.elegansJ.

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