生产菌种的制备与保藏

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1、1,第 六 章 发酵工业生产菌种的制备,2,本章内容,第三节 菌种保藏与复壮,第一节 孢子制备过程与质量控制,第二节 种子制备过程与质量控制,3,发酵工程最重要的就是菌种，发酵水平的高低与菌种的性能、质量、数量有直接关系。 目前工业规模的发酵罐容积已达到几百立方米甚至上千立方米，如按510%接种量计算，就要投入几十立方米或几百立方米的种子，种子液还要有一定的菌浓和其它质量要求。 要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。,4,这就是菌种扩大培养(简称菌种培养)： 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶

2、及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为菌种。 其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。,种子罐,5,发酵工业生产中菌种扩大培养的目的 为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的纯菌种。 因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，成熟菌体接种量大，发酵时间则短。 足够数量的成熟菌种接入到发酵罐，有利于缩短发酵周期，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。 从保存的休眠体，逐步培养，到最后一级菌种，其培养基和培养条件逐步接近发酵罐，驯化菌种适应发酵环境，有利于快速的大量产生代谢产物。,6,发酵工业生产工程中作为菌种必须满足以下条件： 菌种细胞的生长活力强，

3、移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； 生理形状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。,7,沙土孢子,冻干孢子,斜面孢子,摇瓶液体 培养,茄瓶斜面 培养,茄瓶 固体培养,种子罐培养,发酵罐培养,种子制备 包括 两个过程,生产孢子的制备过程：将砂土管或冷冻干燥管保藏的菌种接种至斜面培养基上，成熟后挑选正常的菌落再接茄瓶斜面或固体培养基培养制备大量孢子种子。 生产种子的制备过程：制备的孢子移接到摇瓶或种子罐在液体培养基进行扩大培养，制备大量菌丝种子。,8,第一节 孢子制备过程与质量控制,9,一、孢子的制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环

4、节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。 对于产孢子能力强、孢子发芽快、生长繁殖快的菌种可以将固体培养基培养的孢子可直接接入种子罐作为种子； 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢、生长缓慢的菌种，则需要把孢子接入摇瓶中使孢子发芽，摇瓶菌丝再接入种子罐作为种子。,10,第一节 孢子制备过程与质量控制,1、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等； C、N源不要太丰富(碳源约为1%，氮源不超过0.5 %)，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。 C源丰富易造成生长环境呈生理酸性，不

5、利于孢子形成；N源丰富则有利于菌丝繁殖也不利于孢子形成。 放线菌斜面的培养温度大多数为28，少数为37或30 ，培养时间一般47天，也有长至14天的。 孢子成熟后，在24保藏备用，一般存放时间7天，少数可以存放13个月。,11,第一节 孢子制备过程与质量控制,放线菌发酵生产的工艺过程： 母斜面孢子入罐有利于防止菌种变异和染菌； 采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 土霉素生产用龟裂链霉菌： 培养基：小麦麸皮5-7%，琼脂2.0%，调pH6.87.0。 培养条件：36.5的恒温培养3天，再置30恒温培养1天，培养相对湿度50%55%。,12,2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、

6、小米、玉米、麸皮、揉皮的麦粒等天然农产品为培养基。 营养成分适合霉菌孢子繁殖，这些物质表面积大，易于获得大量孢子。 培养温度一般为2528C，培养时间一般为414天。 产黄青霉菌的种子制备,米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。,13,斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等； 培养条件：25、7天，湿度50%左右； 培养基 特点：有利于长孢子，用量少而精细。 大米孢子 培养基：大米及氮源(玉米浆)； 培养条件：25、7天，控制湿度； 培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松， 提高比表面积和氧的传质，营 养适当有利于孢子的生长。 大米孢子的要

7、求：1粒米含1.4106个孢子。 制备好的大米(小米)孢子，可放在24保存备用，或真空抽干至水分含量在10%以下保存备用，一般可连续使用达半年，对稳定生产很有帮助。 抽干法只能用于孢子保存，而不能用于菌丝。,14,米孢子制备工艺流程,浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘不散；,分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度；米粒不要碰到瓶塞；,培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。,保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存,15,对于不产孢子霉菌 赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在

8、茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。,16,3、细菌繁殖体的制备 产芽孢的细菌用斜面或砂土管保存其芽孢，对于不产芽孢的细菌，一般采用斜面保藏营养细胞，在斜面培养基或者摇瓶液体培养基上活化，然后作种子罐种子。 细菌的斜面培养基多采用C源限量而N源丰富的配比，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。 对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养。 培养温度一般为37C、少数为28，时间一般为12天，产芽孢细菌则需要培养510天。,17,谷氨酸棒杆菌AS1.299(不产芽孢) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%， 氯化钠 0.5， 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32，生

9、长18-24小时 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使 用斜面连续传代不超过 3次。,18,孢子制备和下面要讲的摇瓶菌丝制备不用种子罐，工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，所用的设备为超净工作台、培养箱、摇床或小型发酵罐等实验室常见设备，因此将这些培养过程称为菌种室阶段的种子制备。,19,实验室阶段目的： 对于不产孢子和芽孢的微生物：获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。 对于产孢子微生物：获得一定数量和质量的孢子。 对于产孢子数量少、生长、发芽缓慢的微生物：获得一定数量和质量的菌丝体。 培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培

10、养基应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，菌种室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,20,接种要求： 母瓶：活化、纯化，使保藏菌种发芽生长，并去除 变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。 子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落； 接种时密一点，得到大量的孢子。,21,二、影响孢子质量的因素及其控制 种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。 影响孢子质量的因素包括 培养基 培养条件 培养时间和冷藏时间 接种量,发酵工艺学p94，抗生素工艺学p19，26,22,(一)培养基 蛋白

11、胨、琼脂、水质、氨基酸 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。 构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。 例如四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，以及霉菌用的大（小）米，因小麦、大（小）米产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。 蛋白胨加工方法、原料不同、如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。,23,原材料中无机离子、微量元素如Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。 琼脂的牌号不同，对孢子质量也有影响，这是由于不同牌号的琼脂含有不同的无机离子造成的。 水质

12、的影响，地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,24,，,措施 培养基所用原料要经过糖、氮、磷含量化学分析及摇瓶发酵试验合格才可使用； 严格控制灭菌后培养基的质量； 斜面培养基使用前，在适当温度下放置一定时间，减少斜面的冷凝水，水分适中，有利孢子产生； 供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势。 作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。,25,（二）培养条件：温度和湿度

13、 1、温度的影响 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。要获得高质量的孢子，最适温度区间很狭窄，一般各生产单位都严格控制孢子和斜面的培养温度。 如土霉素生产菌种龟裂链霉菌在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。因此，龟菌斜面先在36.5培养3天，再在28.5培养1天，所得的孢子数量比在36.5培养4天所得的孢子数量增加37倍。 对菌种生产能力的影响：菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。,26,2、湿度 制备斜面孢子时，培养空间

14、的湿度对孢子的形成速度、数量和质量有较大的影响。 龟裂链霉菌孢子制备时发现：北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。表中看出相对湿度在4045%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。,27,在南方气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。因此，相对湿度控制在3542%所得孢子质量较好。 一般来说，真菌对湿度要求偏高，放线菌对湿度要求偏低。 为防止冷凝水冲刷斜面，在斜面培养时要将斜面的接种面向下。,28,（三）培养时间和冷藏时间 1、孢子的培养时间 孢子的培养时间对

15、孢子质量有重要影响，一般来说： 过于年轻的孢子经不起冷藏， 衰老的孢子会导致生产能力的下降。 因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段： 孢子发芽和基质菌丝生长阶段； 气生菌丝生长阶段； 孢子形成阶段； 孢子量多、孢子成熟阶段； 斜面孢子衰老、菌丝自溶阶段。,29,2、孢子的冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶

16、。 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。 冷藏时间因菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。,30,（四）接种量 斜面接种量：接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状况，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响 。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。 接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也有影响。,青霉素 球状菌,进罐孢子数量过少，进罐后长出的 球状体过大，影响通气效果； 孢子数量过多，进罐后发酵时不能 很好地维持球状体,一般传代用的斜面孢子

17、要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。,31,三、孢子质量的质量标准和检查 1、斜面孢子/米孢子质量检查 (1)外观检查； (2)无菌检查； (3) 摇瓶生产能力检查 。 2、质量标准 (1) 无杂菌污染； (2) 孢子数足够，发芽率高； (3) 生产能力高； (4) 真空干燥后含水量小于8%。,32,第二节 种子制备过程与质量控制,33,一、种子制备过程 广义的种子制备包括孢子制备和菌丝制备，狭义的种子制备单指： 将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。 种子罐培养一

18、方面获得足够数量的菌种，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵培养液成分和培养条件，如通无菌空气，搅拌形式等，以使菌体适应发酵环境，起驯化作用。,34,1、摇瓶种子制备 某些产孢子能力不强或孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将菌丝或孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。 摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。 种子培养基要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的培养基配方。,如：灰色链霉菌生产链霉素 卡那链霉菌生产卡那霉素,35,2、种子罐种子制备 种子罐种子制备是指菌种室制备的孢子或液体种子

19、移种至种子罐扩大培养。 种子培养在种子罐里面进行，在工厂归发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。 (1) 种子罐的作用： 使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌(丝)体，满足发酵罐内菌体生长和产物合成的需要。 (2) 种子进入种子罐方式：,孢子进罐法 摇瓶菌丝进罐法,36,孢子进罐法：是将固体培养基培养的孢子制成孢 子悬浮液直接接入种子罐的方法。 优点：可减少批与批之间的差异，稳定生产； 工艺过程简单，一次可以制备大量的孢 子，便于控制孢子质量。也易于保存； 操作简便、不易污染杂菌。 摇瓶菌丝进罐：定义你们自己做。 优点：对于生长、发芽缓慢的菌种，可以缩短种 子在种子罐

20、内的培养时间， 缺点： 现制现用，菌丝不易保存； 批与批之间差异，易造成生产波动； 孢子制备工艺拖长，增加染菌机会。,菌种 入罐 方法,获得好的发酵结果,37,(3) 种子罐级数的确定 种子罐制备种子需逐级扩大培养的次数称作种子罐级数。 一级种子：把孢子瓶中的孢子或摇瓶菌丝接入到种子罐中，孢子发芽并繁殖成的大量菌体(丝)。 二级种子：是指把一级种子接入到体积更大的种子罐中，经培养后形成更多的菌体(丝) 。 一级发酵：采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，称为一级发酵。通常在进行小型罐（5500L）实验时。 二级发酵：一级种子转入发酵罐内的发酵称为二级发酵。 依此类推：发酵级数 = 种子罐的级数

21、+ 1。,38,种子罐的级数确定主要决定于 种子的传代稳定性； 孢子发芽及菌丝繁殖速度； 孢子瓶中孢子的密度； 发酵罐的容积和接种量的要求。 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发 酵即可； 霉菌：生长较慢，如青霉菌，采用三级发酵； 放线菌：生长更慢，采用四级发酵； 酵母：比细菌慢，比霉菌、放线菌快，通常用二级发酵。,39,谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32培养710h，菌体浓度达108109个/mL，即可接入发酵罐作为种子。 青霉素生产菌种，生长较慢，其孢子液接入一级种子罐扩培于27培养40h，孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的二级种子罐，于27培养10

22、24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。 产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌，产孢子能力弱、孢子发芽慢，先将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子罐种子。,40,确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少变异和染菌机会； 但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会； 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,41,种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。1、种子质量标准及判

23、断 种子质量标准因产品、菌种及工艺条件不同而有所不同。生产上常用的种子质量标准： (1) 细胞或菌体：看颜色、闻气味；显微镜下观察菌体形态；测定菌体浓度和粘度等。 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。 菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期， 菌体量未达到高峰。,离心沉淀法、光密度法、细胞记数法,42,分批发酵条件下，黄色短杆菌TK0303的菌体形态变化,5L罐延迟期（4h）,5L罐对数期（32h）,5L罐稳定期（48h）,5L罐衰亡期（68h）,摇瓶衰亡期（72h）,43,

24、产黄青霉在青霉素发酵时，菌丝体的生长分6个时期， 期：分生孢子发芽。孢子先膨胀再形成小的芽管，此时原生质未分化，具有小空孢。 期：菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，在期末有类脂肪小颗粒。 期：形成脂肪粒，积累贮藏物。原生质嗜碱性仍很强。 期 脂肪粒减少，形成中、小空孢子。原生质嗜碱性弱。 期 形成大空孢子其中含有一个或数个染色的大颗粒。脂肪粒消失。 期：细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。 其中I期初称菌丝生长期。产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多。期适于作发酵用种子。期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势渐减弱。大量产生青霉素。期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。,44,放线菌,菌丝团,霉菌菌丝,45,

25、2、生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 3、产物生成量：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 4、特异性酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联，如土霉素即可通过测定种子液中淀粉酶活力判断种子好坏。 5、无杂菌污染。,46,二、影响种子质量的因素及控制 种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。 孢子质量、 培养基、 培养条件、 种龄 接种量,47,1、培养基： 选择有利于孢子发芽和菌体生长的营养成分，使菌丝粗壮并具有较强的活力； 要易于被菌体直接吸收和利用，如葡萄

26、糖、玉米浆、磷酸盐等 ； 营养成分要比发酵培养基适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高； 组分要尽可能与发酵培养基相近，这样种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐的培养条件(驯化)。 种子培养基的pH要比较稳定，以适合菌的生长和繁殖。,48,谷氨酸发酵培养基成分表,49,2、培养条件 种子培养应选择最适温度，该温度与发酵最适温度可能不一致。 通气搅拌的控制很重要：不同时期的需氧量不同；通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象； 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。 青霉素生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它

27、们的发酵单位可相差1倍。 土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。 泡沫影响正常的通气搅拌，应控制培养基的灭菌质量，甚至考虑改变培养基配方，以减少发泡。,50,3、种龄 种龄：种子培养时间称为种龄。菌体的生理活性因不同的生长阶段而差别很大，种龄的控制就显得非常重要。 最适的种龄的选择：在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时的培养时间较为合适。,对数生长期的种子,生长繁殖快，缩短在发酵罐中的延滞期,缩短非产物合成时间，提高发酵罐利用率,很快适应发酵环境,51,前期生长缓慢，发酵周期延长,种龄过于年轻,造成异常发酵,产生泡沫多,菌体量过少，而菌丝结团,

28、产物形成时间推迟,种龄过长,菌种趋于老化，菌体自溶早,生产能力下降,52,不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄有很大差异，一般需经过多种实验来确定。 细菌的种龄一般为724h， 霉菌种龄一般为1650h， 放线菌种龄一般为2164h。,种龄对嗜碱性芽孢杆菌 产生碱性蛋白酶产酶的影响,酶活力(U/mL),53,54,4、接种量 菌种特性(繁殖速度) 决定接种量的大小的因素 种子质量 发酵条件 不同的微生物其发酵的接种量是不同的，通常： 细菌15%，如肌苷酸发酵为1.52%； 酵母菌510%；霉菌一般为10%； 多数抗生素发酵接种量为715%，有时可加大到2025%。,移入种子液的体积 接种量 1

29、00% 接种后培养液的总体积,55,接种量过大或者过小，均会影响发酵。,嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种量对产酶的影响,1%接种量产酶活最高，在0.54%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则酶产量明显下降。,56,种子液中含有大量水解酶，有利于对发酵培养基的利用,提高生产效益,缩短发酵罐中菌体繁殖达峰的时间,产物合成 提前到来,种子进入发酵 罐后容易适应,较大接种量,缩短发酵周期,减少染菌机会,产物合成受影响,菌体生长过快，营养基质缺乏,接种量过大,培养液黏度增加，引起溶氧不足,过多移入代谢废物,57,发酵异常,菌丝量少 还可能产生菌丝团,发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长,接种量过小,

30、但是，对于某些品种，较小的接种量也可以获得较好的生产效果。 如生产制霉菌素，发酵的接种量为1%时效果好于10%，0.1%的接种生产效果和1%相似；,58,近年来，生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施，是发酵生产的发展趋势。 以上三方法运用得当，可提高发酵产量， 卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且达到产量高峰的时间提前。 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。 但染菌机会和变异机会增多。,双种法：2个种子罐的种子接入1个发酵罐,加大接种量的方法,混种进罐法：以种子液和发酵液混合作为 发酵罐的种子。,倒种法：以适宜的发酵液倒出部分给另一 发酵罐作为种子。,59,三、种子

31、异常的分析 种子异常往往表现为 (1),孢子质量,菌种生长代谢缓慢原因,种子罐的 培养条件,空气的进罐温度较低,培养基原材料质量差,菌种生长代谢缓慢 菌丝结团 三个方面 菌丝粘壁,应对：培养基灭菌后需取样测定C、N、P、 pH值，以判断培养基的灭菌质量。,培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多,接种量太小,前一级种子质量太差,泡沫多通气差,60,(2) 菌丝结团 菌丝团：在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散 舒展而聚成团状称为菌丝团。 一个菌丝团可以由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。在种子液中可看见白色的小颗粒。,影响菌体的呼吸,影响菌体对营养物质的吸收,菌丝团的影响,搅拌

32、效果差,接种量小,菌丝团产生的原因,较多时移入发酵罐影响正常发酵,放线菌分散舒展的菌丝形态,61,(3)菌丝粘壁 菌丝粘壁：发酵过程中，菌丝粘附在罐壁上的现象。,菌丝浓度减少,形成菌丝团,菌丝粘壁的后果,搅拌效果差,种子罐装料系数小,菌丝粘壁的原因,泡沫过多,62,四. 种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中表现出来的生产能力。因此： 必须保证生产菌种的稳定性； 保证无杂菌侵入。 1. 菌种稳定性的检查方法： 取少量菌种无菌生理盐水梯度稀释(以长出单菌落不至过密为宜) 平板划线培养。 挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。以不低于其原有的生产活力为原则，并

33、取生产能力高的菌种备用。,63,2. 无菌检查： 显微镜观察、肉汤或琼脂斜面接入种子液进行无菌检验。 种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。 3.生化分析： 营养成分消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽、气味等。,64,五、发酵生产中种子罐的无菌接种 生产规模种子罐的接种，包括两个方面： 从种子室摇瓶菌丝或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐； 从一个种子罐移入另一个生产种子罐或发酵罐中。 是通过灭菌接种管道，在压差作用下进行的。,65,摇瓶菌丝或孢子悬浮液接种种子罐 火焰封口法： 在种子罐接种口周围点燃酒精火焰圈，使接种口被围在一圈火焰之中，在火焰圈中即

34、可将菌悬液倒入种子罐中。,火焰封口法 压差法,66,压差法,针头法 胶管法,67,68,69,作业：,1.什么是菌种退化？菌种退化表象？引起菌种退化原因？防止菌种退化措施？ 2.什么是菌种复壮？菌种复壮的方法？ 3.菌种保藏的意义、目的、原理、注意事项？ 4.各种菌种保藏方法的技术要点？,70,一、菌种保藏 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料。特别是利用微生物进行有关生产(如抗生素、氨基酸、酿造) 更离不开菌种，因此菌种是国家的重要资源，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 2、菌种保 藏目的,第三节 生产菌种的保藏与复壮,保持优良生产性能的稳定,不污染杂菌,不

35、死亡,71,3、菌种保藏的原理： 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，使菌种处于“休眠”状态(孢子、芽孢等) ，抑制其繁殖能力，以减少其变异，达到长期保存的目的。 好的保藏方法，应能保持菌种优良特性和较高存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。,72,4、几种常用菌种保藏方法,73,5、菌种保藏的注意事项 （1）菌种在保藏前所处的状态 菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡，培养时间长，生产性能衰退。 一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效

36、果较好。,74,（2）菌种保藏所用的基质 培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。 砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。 冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。,75,（3）操作过程对细胞结构的损害 冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。 真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。,76,二、菌种的复壮 菌种衰退：菌种

37、经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。 1、常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,77,2、衰退的原因： (1)基因突变； 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变则会引起产量下降，如果控制孢子生成的基因发生负突变则孢子性能就会下降。当然，这些负突变都是自发形成的。经常处于旺盛生长状态的细胞比休眼状态细胞发生突变的机率大得多。 很多抗生素生物合成、产生气生菌丝和色素等性状都部分或全部受质粒基因控制。当菌株连续

38、传代、菌体发生质粒脱落而出现大量光秃型菌落，则生产能力也显著下降。,78,(2)变异菌株性状分离； 诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成；诱变育种时，所得到的优良菌株的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成。 菌落由一个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞； 单核孢子发生突变时，双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化；,79,(3)连续传代 连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。 产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系,80,产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代

39、过程中产量和回复子数量间的关系,由上表可见，虽菌种总的保存时间都是147天，但随着移植代数的增加，回复突变率也增加，腺苷产量下降。这也说明，退化并不突然明显，而是当退化细胞在繁殖速率上大于正常细胞时，每移植一代，使退化细胞的优势更为显著，从而导致退化。,81,(4)其它因素 菌种保藏不当； 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）。 如温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少，又例在产腺苷的黄膘吟缺陷型中，若在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤及组氨酸和苏氨酸可降低回复突变的数量。,82,3、防止菌种衰退的方法 控制传代次数（一般在DNA的复

40、制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8 10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。 分离复壮,83,4、菌种的复壮： 狭义的复壮：是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。 广义的复壮：是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。

41、复壮措施有三：,选优 汰劣,84,(1)纯种分离 采用自然分离的方法，把衰退菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，通过扩大培养可以恢复菌种的原有性状。 (2)淘汰衰退的个体 如芽孢产生菌经高温(80 )处理，则不产芽孢的个体被淘汰。 (3)选择合适的培养条件 一般来说将保藏后的菌种接种在保藏前所用的同一培养基上，有利于菌种原有性状的恢复。,85,本章思考题,种子扩大培养：种龄：接种量；菌种衰退： 种子制备一般包括哪两个过程？ 种子质量主要受哪些因素的影响？ 种子异常的表现。 一般衰退菌种的主要复壮措施。 在丝状菌液体发酵的过程中容易产生菌丝团的原因？ 为了加大接种量，维持正常生产，常采用哪些方法。 种子质量的优劣，主要取决于哪几个方面。 生产中，种子生长、代谢缓慢的主要原因。,86,1.为什么最适的种龄一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种？接入种龄过早、过老的种子会有哪些害处？ 2. 培养基是影响种子质量的主要因素之一，为了保证种子质量，对培养基有何要求？ 3. 以大接种量和丰富培养基作为高产措施，大接种量有哪些好处？接种量过大、过小又有哪些弊端？ 4.生产上种子质量标准有哪些？,