旋光光谱和圆二色谱ppt课件

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1、旋光光谱和圆二色谱旋光光谱和圆二色谱u 旋光光谱（旋光光谱（optical rotatory dispersion，ORD）u 圆二色谱（圆二色谱（circular sichroism，CD）分别于分别于20世纪世纪50年代和年代和60年代发展起来的仪器分析年代发展起来的仪器分析方法，都是利用电磁波和手性物质相互作用的信息来方法，都是利用电磁波和手性物质相互作用的信息来研究化合物的立体结构及其它有关问题。研究化合物的立体结构及其它有关问题。偏振光与手性物质的相互作用偏振光与手性物质的相互作用 旋光光谱旋光光谱 圆二色谱圆二色谱 康顿效应及康顿效应及ORD、CD和和UV间的关系间的关系 应用应用

2、 注意事项注意事项 1、光的偏振态、光的偏振态（1）自然光与线偏振光（或平面偏振光）自然光与线偏振光（或平面偏振光）普通光源中的原子和（或）分子能够独立发光，所发出的光普通光源中的原子和（或）分子能够独立发光，所发出的光 波中具有各个方向的光矢量，在与传播方向相垂直的平面波中具有各个方向的光矢量，在与传播方向相垂直的平面 内，在所有可能的方向上，内，在所有可能的方向上，E的振幅都相等的振幅都相等自然光自然光如果光矢量只在一个固定的平面内，并沿一个固定方向振如果光矢量只在一个固定的平面内，并沿一个固定方向振 动动线偏振光或平面偏振光线偏振光或平面偏振光光矢量的振动方向与光的传播方向所构成的平面光

3、矢量的振动方向与光的传播方向所构成的平面振动面振动面一、偏振光与手性物质的相互作用一、偏振光与手性物质的相互作用（2）圆偏振光）圆偏振光振幅保持不变，而方向周期变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进 可看成是两个相互垂直的振幅相等、相位差为可看成是两个相互垂直的振幅相等、相位差为/2的线偏的线偏振光的合成振光的合成/2对应于右旋圆偏振光对应于右旋圆偏振光/2对应于左旋圆偏振光对应于左旋圆偏振光即圆偏振光中包含着两个频率和振幅相同的左旋和右旋圆偏振即圆偏振光中包含着两个频率和振幅相同的左旋和右旋圆偏振光光2、偏振光的获得、偏振光的获得（1）布儒斯特定律）布儒斯特定律 入射角为入射角为0时时 反射光与折

4、射光相互垂直，此时反射光与折射光相互垂直，此时0为布儒斯特为布儒斯特角或起偏角，反射光为线偏振光角或起偏角，反射光为线偏振光 若自然光从空气射到折射率为若自然光从空气射到折射率为1.50的玻璃上，起偏角为的玻璃上，起偏角为56.3，折射角为折射角为33.7。（2）晶体的双折射现象）晶体的双折射现象 当自然光射入双折射晶体时，两束折射光当自然光射入双折射晶体时，两束折射光o和和e都是线偏都是线偏振光，并且它们的振动面通常接近于相互垂直振光，并且它们的振动面通常接近于相互垂直（3）二向色性晶体）二向色性晶体 有些透明晶体不仅具有双折射现象，而且对有些透明晶体不仅具有双折射现象，而且对o光和光和e光

5、有不光有不同的吸收作用，这种晶体称为二向色性晶体，如电气石晶具有同的吸收作用，这种晶体称为二向色性晶体，如电气石晶具有很强的二向色性，硫酸碘奎宁晶体很强的二向色性，硫酸碘奎宁晶体（4）波片）波片也称波晶片或相位延迟片也称波晶片或相位延迟片 若让线偏振光的振动面与若让线偏振光的振动面与1/4波片的光轴成波片的光轴成45角，则分解后角，则分解后的的o光和光和e光振幅相等，从晶片的另一表面出射的光则是圆偏振光振幅相等，从晶片的另一表面出射的光则是圆偏振光。光。3、圆偏振光在手性介质中传播时的特点：、圆偏振光在手性介质中传播时的特点：（1）左、右旋圆偏振光在手性介质中的传播速度不等，导）左、右旋圆偏振

6、光在手性介质中的传播速度不等，导致透射出的面偏振光与入射角成一致透射出的面偏振光与入射角成一角，表现出旋光。角，表现出旋光。（2）手性介质对两种圆偏振光的吸光强度不同，由它们合成）手性介质对两种圆偏振光的吸光强度不同，由它们合成的出射光不再是一个平面的偏振光，而是一个右旋或左旋的的出射光不再是一个平面的偏振光，而是一个右旋或左旋的椭圆偏振光。椭圆偏振光。二、旋光光谱（二、旋光光谱（ORD）1、当平面偏振光通过手性物质时，偏振面会发生旋转，即该物、当平面偏振光通过手性物质时，偏振面会发生旋转，即该物 质具有旋光性，旋转的角度质具有旋光性，旋转的角度旋光度旋光度 2、原理原理（1）介质为对称结构时

7、，左右旋圆偏振光的传播速度相同，）介质为对称结构时，左右旋圆偏振光的传播速度相同，则它们的折射率则它们的折射率n相等相等 因因nc/c:真空中光速真空中光速 :介质中光速介质中光速 n=nL-nR=0 偏振面保持不变偏振面保持不变（2）介质为不对称结构时，）介质为不对称结构时，nLnR n 0 偏振面发生旋转，随光程增大而增大偏振面发生旋转，随光程增大而增大旋光现象旋光现象3、测定仪器、测定仪器4、旋光度：、旋光度：实实比旋光度：比旋光度：D(实实/cl)100通常用钠光通常用钠光D线线(589.3nm)测量测量实实l:试样槽厚度（试样槽厚度（dm）c:100ml溶剂中溶液的溶剂中溶液的g数数

8、不同波长的不同波长的(比旋光度比旋光度)为纵坐标，为纵坐标，为横坐标可得为横坐标可得ORD光谱光谱:摩尔比旋光度，常用其代替摩尔比旋光度，常用其代替=Mr/100(度度cm2dmol-1)Mr:待测物质的摩尔质量待测物质的摩尔质量三、圆二色谱三、圆二色谱1、手性物质对组成平面偏振光的左、右旋圆偏振光、手性物质对组成平面偏振光的左、右旋圆偏振光的吸光度不同，即的吸光度不同，即L R 这种现象为圆二色性这种现象为圆二色性CD谱：谱：为纵坐标，为纵坐标，为横坐标为横坐标:摩尔椭圆度，常用其代替摩尔椭圆度，常用其代替两者关系两者关系:=3300=3300(L-R)2、的物理意义的物理意义 当平面偏振光

9、通过手性介质时，不仅左、右旋圆偏振光当平面偏振光通过手性介质时，不仅左、右旋圆偏振光的传播速度不同，而且强度也不同。用箭头的长短代替强的传播速度不同，而且强度也不同。用箭头的长短代替强度。因而光在传播时，它的矢量和将产生的一椭圆轨道度。因而光在传播时，它的矢量和将产生的一椭圆轨道长轴：矢量相位相同时的强度长轴：矢量相位相同时的强度短轴：矢量相位相反时的强度短轴：矢量相位相反时的强度：平面偏振光离开样品槽的：平面偏振光离开样品槽的 角度角度椭圆度椭圆度=M/100lc=33003、测量装置、测量装置四、康顿效应四、康顿效应(cotton effect)及及ORD、CD和和UV间的关系间的关系1、

10、在紫外和可见区内无发色团的饱和化合物，则、在紫外和可见区内无发色团的饱和化合物，则ORD光谱呈光谱呈现单调下降或上升的曲线，若手性化合物的紫外吸收在仪器现单调下降或上升的曲线，若手性化合物的紫外吸收在仪器测量范围内则出现测量范围内则出现S型曲线称型曲线称cotton效应效应即形成一个峰和一个谷组成的即形成一个峰和一个谷组成的ORD谱线谱线简单的简单的Cotton效应效应正正Cotton效应：波长由长波向短波移动时，效应：波长由长波向短波移动时，ORD谱由峰向谱由峰向 谷变化谷变化负负Cotton效应：波长由长波向短波移动时，效应：波长由长波向短波移动时，ORD谱由谷向谱由谷向 峰变化峰变化k:

11、ORD线与零线相交点线与零线相交点振幅：谷至峰的距离振幅：谷至峰的距离摩尔振幅摩尔振幅=(1-2)/1001:ORD顶峰处的摩尔旋光度顶峰处的摩尔旋光度2:ORD谷底处的摩尔旋光度谷底处的摩尔旋光度2、CD的康顿效应的康顿效应正的康顿效应：正的康顿效应：或或为正值且有峰的为正值且有峰的CD曲线曲线负的康顿效应：负的康顿效应：或或为负值且有谷的为负值且有谷的CD曲线曲线3、ORD、CD和和UV光谱间的关系光谱间的关系（1）ORD和和CD是同一现象的两个方面，都是光与是同一现象的两个方面，都是光与手性物质作用而产生的。主要目的是研究手性化合手性物质作用而产生的。主要目的是研究手性化合物的构型与构象

12、，在该方面两者提供的信息总是等物的构型与构象，在该方面两者提供的信息总是等价的。价的。UV反映了光与分子的能量交换。反映了光与分子的能量交换。(2)理想情况下理想情况下：max（UV）=max(CD)=k(ORD)实际情况实际情况：三者接近，但不：三者接近，但不一定重合一定重合ORD谱和谱和CD谱都可用来测谱都可用来测定有特征吸收的手性化合物定有特征吸收的手性化合物的绝对构型的绝对构型CD谱：容易解析谱：容易解析ORD谱：比较复杂谱：比较复杂 不对称分子某生色团吸收峰的不对称分子某生色团吸收峰的Cotton effect 的的正负号与该生色团的手性中心的构型有关联，故正负号与该生色团的手性中心

13、的构型有关联，故可分析分子的绝对构象。可分析分子的绝对构象。ORD摩尔振幅摩尔振幅与与CD谱中谱中或或的关系的关系=0.0122=40.281、在立体结构化学研究中的应用、在立体结构化学研究中的应用 对于羰基化合物，特别是环酮类化合物的研究较多，并形成了对于羰基化合物，特别是环酮类化合物的研究较多，并形成了半经验的半经验的“八区律八区律”来推测其立体结构：八个区域的划分如下图所来推测其立体结构：八个区域的划分如下图所示：示：五、应五、应 用用将环己酮按图放好：将环己酮按图放好：观察者迎着观察者迎着O=C的方向即从的方向即从Y轴的负方向看轴的负方向看Y轴的正方向。轴的正方向。三个互相垂直的三个互

14、相垂直的A、B、C平面将环己酮分割为八个区：平面将环己酮分割为八个区：OC前面的前面的4个区由于取代基很难进入，对个区由于取代基很难进入，对cotton效应贡效应贡献小，不考虑献小，不考虑OC后面的后面的4个区贡献大，其对个区贡献大，其对cotton效应正负号的贡献效应正负号的贡献如下图所示：如下图所示：C1,C2,C6A面上面上C2,C6的的e键键几乎在几乎在A面上面上C2，C6的的a键键分别在下右和下左分别在下右和下左O，C1，C4B面上面上八区律八区律1、位于三个平面上的取代基，对、位于三个平面上的取代基，对cotton效应贡献为效应贡献为02、位于正负区的取代基效应可以抵消、位于正负区

15、的取代基效应可以抵消3、取代基的贡献大小与性质有关、取代基的贡献大小与性质有关4、取代基对、取代基对cotton效应的贡献大小随着与生色团的距离增大效应的贡献大小随着与生色团的距离增大 而变小而变小2,2,5-三甲基环己酮为例：三甲基环己酮为例：b是是a的投影图，可看到：的投影图，可看到：C1，C2，C4，C6，C7均处于分割面上，对均处于分割面上，对cotton效应贡献为效应贡献为0 C3与与C5抵消，抵消，C8与与C9正，正，所以该化合物应有正的所以该化合物应有正的cotton效应效应例例2、天然油脂得一产物为、天然油脂得一产物为3羟基羟基3十九烷基环己十九烷基环己酮，有正的酮，有正的co

16、tton效应，试指出它的构型效应，试指出它的构型解：按八区律，解：按八区律，S构型应有正的构型应有正的cotton效应，效应，R构型应有负的构型应有负的 cotton效应效应,故该环己酮衍生物为故该环己酮衍生物为S构型构型2、生物大分子构型、构象的研究、生物大分子构型、构象的研究（1）蛋白质或多肽中主要得光活性基团是肽链骨架中的肽键、）蛋白质或多肽中主要得光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键可产生芳香氨基酸残基及二硫桥键可产生CD光谱，因而可用于蛋白质光谱，因而可用于蛋白质二、三级结构和氨基酸微环境的检测。二、三级结构和氨基酸微环境的检测。（a）蛋白质）蛋白质CD谱谱远紫外区

17、远紫外区：(1)178-250nm 反映肽鍵的反映肽鍵的CD 肽鍵是高度有规则排列的，排列方向决定了肽鍵能级跃迁肽鍵是高度有规则排列的，排列方向决定了肽鍵能级跃迁的分裂情况的分裂情况 二级结构不同，其二级结构不同，其CD位置、吸收强度则不相同位置、吸收强度则不相同(2)-螺旋：192nm有一正谱带222209有两个负的特征峰-折叠 216nm:负峰185-200nm:正谱带-转角：转角：206nm有一正谱带有一正谱带左手螺旋的左手螺旋的P2结构：有负的谱带结构：有负的谱带近紫外区近紫外区:(1)250-320nm-处于不对称微环境的芳香氨基酸残处于不对称微环境的芳香氨基酸残基、二硫鍵基、二硫鍵

18、(2)可作为光谱探针研究它的不对称微环境的扰动可作为光谱探针研究它的不对称微环境的扰动(b)研究蛋白质的二级结构研究蛋白质的二级结构通过远紫外通过远紫外CD谱研究蛋白质谱研究蛋白质-螺旋、螺旋、-折叠折叠、-转角结构的分量转角结构的分量(C)研究蛋白质三级结构：研究蛋白质三级结构：chymotrypsin(all b)lysozyme(a+b)triosephosphate isomerase(a/b)myoglobin(all a)三级结构模型可分为：三级结构模型可分为：全型-螺旋 40%-折叠 5%全型-螺旋 40%+型：型：-螺旋、螺旋、-折叠均大于折叠均大于15%，这两种结构在空间是，

19、这两种结构在空间是分离的，分离的，60%的折叠链是反平行的的折叠链是反平行的/型：型：-螺旋、螺旋、-折叠均大于折叠均大于15%，这两种结构在空间上，这两种结构在空间上是相间的，是相间的，60%的折叠链平行排列的折叠链平行排列(d)研究氨基酸残基的微环境：研究氨基酸残基的微环境：蛋白质中芳香氨基酸残基：色氨酸(Trp)酪氨酸(Tyr)苯丙氨酸(Phe)二硫鍵处于不对称微环境时250-320nm出现CD信号Trp:279,284和和291nmTyr:277nmPhe:255,261和和268nm二硫鍵二硫鍵:整个近紫外整个近紫外CDCD谱谱例：阳离子表面活性剂例：阳离子表面活性剂CPB诱导诱导B

20、SA构象构象CD光谱的变化光谱的变化 Figure 3 Far-UV CD(a)and near-UV CD(b)spectra of BSA and BSA in CPB1.BSA;2.BSA in 1.0 10-5mol/L CPB;3.BSA in 1.0 10-4 mol/L CPB由远紫外由远紫外CD谱可以看出谱可以看出 -螺旋螺旋 -折叠折叠 BSA 49%9.8%CPB（第一（第一CMC）78%7.6%CPB（第二（第二CMC）37%10.5%由近紫外由近紫外CD谱可以看出谱可以看出 自然状态下自然状态下BSA分子的分子的near-UV CD光谱图中在光谱图中在261 和和268

21、 nm处有最小值，在处有最小值，在277 和和284 nm处有两个肩峰。当加入处有两个肩峰。当加入CPB后，后，261和和268 nm处的椭圆率增加，而处的椭圆率增加，而280 至至300 nm处的椭处的椭圆率降低，表明此时氨酸酸残基周围环境的极性发生了变化圆率降低，表明此时氨酸酸残基周围环境的极性发生了变化，这种变化是由于双硫键桥的不对称性遭到破坏而引起这种变化是由于双硫键桥的不对称性遭到破坏而引起BSA分子分子三级结构变化的结果。三级结构变化的结果。(2)核酸核酸(a)278nm有一强正的有一强正的cotton效应效应-对应于碱基的堆积对应于碱基的堆积 248nm有一弱的负的有一弱的负的c

22、otton效应效应-对应于螺旋性对应于螺旋性(形形)220240260280300320-10-505101520(mdeg)Wavelength(nm)fsDNA ctDNAZ-form:290nm有一负的cotton效应A-form:280nm有正的cotton效应243nm有负的cotton效应正的强度约为负的强度的3倍(b)典型的典型的DNA构型构型B-form:277nm有正的cotton效应245nm有负的cotton效应C-form:285nm有正的cotton效应(弱)250nm有负的cotton效应(强)3、诱导园二色谱、诱导园二色谱(1)主客体化合物主体为手性客体为非手性，

23、但有吸收会产生诱导园二色谱例如环糊精与客体相互作用包结-产生诱导园二色谱客体结合在环糊精外部-不产生诱导园二色谱若客体的电偶极矩与环糊精Z轴重合正cotton效应若客体的电偶极矩与环糊精Z轴垂直负cotton效应六、实验中几个注意事项六、实验中几个注意事项l 用用N2除臭氧和氧气；除臭氧和氧气；l 样品的浓度应使其吸光度在样品的浓度应使其吸光度在0.61.2之间，可得到较好之间，可得到较好 的信躁比，对蛋白质来说浓度在的信躁比，对蛋白质来说浓度在0.2mg/mL，池子长度，池子长度 是是1mm，池体积是，池体积是350mL；l 溶剂和缓冲溶液选择的原则是使样品在测定的波长范围溶剂和缓冲溶液选择

24、的原则是使样品在测定的波长范围 内其吸光度尽量的小（溶剂的吸收表如下）；不能用内其吸光度尽量的小（溶剂的吸收表如下）；不能用 HCl来调来调pH，因为在低的，因为在低的UV波段波段Cl-离子会干扰离子会干扰CD的的 测定测定l 狭缝带宽（狭缝带宽（SBW）的选择：）的选择：SBW应保持至少为应保持至少为NBW （被扫描物质的自然带宽）的十分之一；（被扫描物质的自然带宽）的十分之一；在远紫外一般为在远紫外一般为2nm；如果如果NBW不知，可选择不同不知，可选择不同SBW进行实验；进行实验；溶剂的吸收表溶剂的吸收表v Acceptable:1.Potassium Phosphate with KF,K2SO4 or(NH4)2SO4 as the salt.2.Hepes,2mM.3.Ammonium acetate,10mM.v Avoid:Tris;NaCl;Anything optical active,e.g.Glutamate