实验八聚炳烯凝胶电泳

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1、,血清蛋白的分离- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法,一、实验目的,学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术,二. 基本原理,(一) 电泳 电泳: 带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象.,(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳,用丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质.以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。,1. 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性,(1) 凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好； (2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。 (3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联

2、剂的浓度调节凝胶的孔径； (4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,3 凝胶聚合催化体系,（1）光催化：核黄素,（2）化学催化：AP-TEMED 催化体系,Bis将单体长链间连成网状结构,化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度 pH 碱性条件 温度 分子氧 杂质,4.聚丙烯酰胺凝胶种类 (1) 连续系统与不连续系统两大类,不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于

3、浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。,(2)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶,浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。,1) 样品浓缩效应 A. 凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C. 电位梯度的不连续性

4、2) 分子筛效应 3) 电荷效应,(3) 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用,三. 实验器材,1、电泳仪,电泳槽及其附件 2、培养皿 3、摇床 4、烧杯 5、移液管 6、微量进样器 7、针管,电 泳 装 置,电泳仪： 提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移,垂直平板电泳槽,每组（3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。,四. 实验试剂,人血清； 分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液 PH8.9； 浓缩胶缓冲液: Tris-HCl缓冲液 PH6.7； 分离胶贮液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至100ml； 浓缩胶贮液: Acr10.0g,Bis

5、2.5g,无离子水溶解定容至100ml； 过硫酸铵溶液（AP） 电泳缓冲液: Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3； 固定染色液 脱色液,(一) 垂直平板电泳槽的安装 (二) 凝胶的制备 (三) 加样 (四) 电泳 (五) 固定和染色 (六) 脱色,五. 操作步骤,五. 操作步骤,(一). 垂直平板电泳槽的安装,注意短玻璃板是向内侧的。,要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶。,(二). 凝胶的制备,1 分离胶的制备 (7%) 配8 mL (按如下顺序加入）,分离胶缓冲液 1 mL 分离胶贮液 2 mL 去离子水 4 mL TEMED 2 uL 过硫酸胺（AP) 1 mL,将上述试剂迅

6、速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至2/3处，再取大约3 mL的水加在上面直至凝胶凝固为止。,加入此物后请迅速混匀加样，否则易凝固无法加样,凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.,水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡,2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。,3.浓缩胶的制备 (2.5%) 配 4 mL(按如下顺序加入）,浓缩胶缓冲液 0.5 mL 浓缩胶贮液 1 mL 去离子水 2 mL 过硫酸胺（AP) 0.5 mL,迅速混匀,用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面,直至上边缘, 迅速插入加样梳, 室温静置一段时间. 加样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平，注

7、意梳子的朝向，平的一面贴长玻板.,凝胶凝聚后，垂直小心拔出加样梳，用窄条滤纸吸在玻板边缘吸去多余的液体。,(三). 进 样,除去底板，将制胶装置放在电泳槽内， 加入稀释10倍的Tris甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先从内槽加入，上面没过短玻璃板，外槽液面没过最下一个螺丝处, 加样前要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.（用针筒将凹洞中的气泡抽出）,用微量进样器取已经混合好的样品 15l ，在距凝胶凹形槽底三分之一处缓缓进样, 每人加2个样，两边各留2 孔不加样，避免边缘效应。 加样时不可过低,以防刺破胶体,(三). 进 样,(四). 电 泳,将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（

8、方向切勿接错），打开电泳仪开关，开始时将电压调至150V，待样品进入分离胶时，将电压调至250V。当蓝色染料迁移至距离凝胶下端2cm时，将电流调回到零，关闭电源。,电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂）在胶板一端切除一角作为标记，用缓冲液冲洗胶板，将其移至大培养皿中染色。 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.,(五). 固定和染色,将凝胶放入固定染色液中，使染色液刚好没过胶板，放到摇床上，缓慢摇动，染色7 min。(注意染色液要用漏斗回收）,(六). 脱 色,放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪去。,六. 实 验 结 果,可在培养皿下衬一白纸

9、，便于观察，用手机拍下凝胶图，打印出来附在实验报告后。,1、Acr和Bis为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应戴手套。 2、玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与 玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断 裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。 3、安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正， 均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏，但亦不可太用力 旋，易将玻板边缘压破。 4、制备浓缩胶时，注意梳齿边缘不能有气泡,胶凝聚后，注意拔梳 子要垂直小心拔出。 5、电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方 向泳动。,注 意 事 项,Thank you for your attention,