分析化学系列课件紫外可见分光光度法学习课件课件

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1、1Ultraviolet and Visible Spectrophotometry;贵阳医学院药学院分析化学教研室O返回 紫外紫外-可见分光光度法简介可见分光光度法简介11.1 紫外紫外-可见吸收光谱的基本概念可见吸收光谱的基本概念11.2 紫外紫外-可见分光光度法的基本原理可见分光光度法的基本原理 11.3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计11.4 定量分析方法定量分析方法11.5 定性及结构分析定性及结构分析（7学时学时)O返回紫外/m 101 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10 10-12 10-14 /s-1 3108 31010 31012 31014 310

2、16 31018 31020 31022无线电波微波红外可见X射线射线400760nm200400nmO返回特点：电子光谱，强度大 灵敏度高，10-710-4 g/mL 准确度0.20.5%应用：定性分析：定性鉴别、纯度检测 定量分析：单组分、多组分(计算分光光度法)结构分析：共轭体系信息O返回 跃迁类型跃迁类型 紫外紫外-可见吸收光谱中的常用术语可见吸收光谱中的常用术语 吸收带及其与分子结构的关系吸收带及其与分子结构的关系 影响吸收带的因素影响吸收带的因素O返回 能在紫外光区产生吸收的有机化合物：不饱和能在紫外光区产生吸收的有机化合物：不饱和且具有共轭系统且具有共轭系统跃 迁类 型波长范围及

3、特点基 团能量含杂原子的不饱含杂原子的不饱和基团和基团 远紫外区(max104，强吸收强吸收 跃迁几率小，跃迁几率小，max E *C=C 共轭共轭 C=CO返回电荷迁移跃迁示意图电子给予体电子接受体NN_R1R2R1R2CCOR+ROhhFe3+SCN-2+Fe2+SCN2+Cl-(H2O)n Cl(H2O)n-hh电子接受体电子给予体电子接受体电子给予体O返回 4、5周期过渡金属元素 镧系、锕系元素 d轨道和f轨道分裂d-d跃迁和f-f跃迁 必须在配体的配位场作用下才能产生O返回lg5432110 100 200 300 400 500 600 700 800/nm/nm10 100 20

4、0 300 400 500 600 700 800远紫外区近紫外区可见区电荷转移配位场共轭O返回 CH2=CH CH2CH2OCH3；上述两个分子能产生哪些类型的电子跃迁？*跃迁、*跃迁、n*跃迁 *跃迁、*跃迁、n*跃迁 有哪些生色团和助色团？生色团：C=C；助色团：OCH3 生色团：苯环、C=OCOCH3O返回强带强带(strong band)max104弱带弱带(weak band)max102O返回A谷谷谷谷肩峰肩峰(shoulder peak)max max min min shO返回 吸收峰的数目取决于分子结构中不饱和基团的种类 吸收峰的位置(max)取决于电子能级差 吸收峰的强弱

5、(max)取决于电子跃迁几率 O返回*、n*n*ClNH2maxmax255nm 215264nm 240280nm 1430exampleO返回吸收带特 点(nm)吸收强度(max)跃迁类型吸 收基 团波长较长波长较长中强中强吸收吸收300210250230270重心重心256 max104（强带）（强带）200强吸强吸收收18047000中强中强吸收吸收2007000芳环共轭芳环共轭 *杂原子不杂原子不饱和基团饱和基团共轭双键共轭双键芳环芳环芳环的离芳环的离域大域大键键 芳环芳环C=C骨架振骨架振动及环内动及环内 *exampleO返回苯的苯的B带吸收光谱带吸收光谱苯蒸气苯蒸气苯的乙醇溶液

6、苯的乙醇溶液苯异丙烷溶液的紫外吸收光谱B带带E1带带E2带带O返回吸收带吸收带 max(nm)max(Lmol-1cm-1)B带带R带带苯乙酮的吸收带lg E2带带K带带生色团生色团O返回共轭系统共轭系统共平面性共平面性共轭效应共轭效应 max（短移），（短移），溶剂极性溶剂极性 K带长移，带长移，R带短移带短移 max 210.5nm,270nm235nm,287nmO返回二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱顺式顺式O返回溶剂极性溶剂极性(n*)(*)*非极性溶剂非极性溶剂极性溶剂极性溶剂*E非非n*极性溶剂对两种跃迁能级差的影响 E极极非极性溶剂非极性溶剂*n极性溶剂极性溶剂 E非非 E极极O

7、返回11.2.1 Lambert-Beer定律定律11.2.1-1 Lambert-Beer定律数学表达式定律数学表达式11.2.1-2 系光吸数系光吸数11.2.2 偏离偏离Beer定律的因素定律的因素O返回截面积S厚度l断层dl，含dn个吸光质点含n个吸光质点的吸光介质IxI0IdS=kdn入射光强透射光强O返回dS/S=(kdn)/S SkdnIdIxx n=VC，S=V/l n/S=l C O返回-lg(I/I0)=ECl(transmitance)：T=I/I0(absorbance)：A=-lgT A=ECl（A与与C成正比关系）成正比关系）T=10-ElC（T与与C成指数函数关系

8、）成指数函数关系）&Lambert-Beer定律：定律：当一束平行单色光垂直通过均匀的非散射吸光物质溶液时，其对光的吸光度与溶液的浓度及厚度成正比，A=ECl。O返回定性和定量的参数定性和定量的参数(/EM)()%11cmEC=1mol/LC=1g/100ml摩尔吸光系数摩尔吸光系数百分吸光系数百分吸光系数浓度单位浓度单位用用 途途mol/Lg/100ml分子结构研究分子结构研究含量测定含量测定两种吸光系数的区别两种吸光系数的区别两种吸光系数的换算关系：两种吸光系数的换算关系：%1110cmEMO返回C99203071015.32310%11cmEMA=ECl307002.0614.0%1Cl

9、AEcm4氯霉素(M=323.15)的水溶液，用纯品配制100ml含有2.00mg的水溶液，=278nm,l=1cm,A=0.614，求、。%11cmEO返回吸光度(A)与浓度(C)关系曲线11.2.2-1 化学因素化学因素11.2.2-2 光学因素光学因素11.2.2-3 透光率测量误差透光率测量误差TTTCClg434.0O返回离解：max350nm,450nm max375nm缔合：溶剂化：减免：控制一定的实验条件（稀溶液、pH范围、溶剂等）I2CCl4紫色C2H5OH绿色来源：n=VCO返回水溶液中Cr()两种离子的吸收曲线亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱Cr2O72-350nmCr2O7

10、2-450nmCrO42-375nmC=6.3610-6 mol/L(单体单体)660nmC=1.2710-4 mol/L(二聚体二聚体)610nmC=5.9710-4 mol/LO返回非单色光非单色光杂散光杂散光(stray light)散射光和反射光散射光和反射光非平行光非平行光&谱带宽度谱带宽度(band width,S)末端吸收末端吸收处产生假吸收处产生假吸收溶液混浊溶液混浊空白对比空白对比实际光程实际光程l AO返回来源：仪器噪音来源：仪器噪音(noise)性质：性质：随机误差随机误差种类：种类：(dark noise)(signal shot noise)暗噪音与迅号噪音的误差曲线

11、暗噪音暗噪音迅号噪音迅号噪音 (或或T=2065%)O返回11.3.1 主要部件主要部件11.3.2 常见光路类型常见光路类型11.3.3 一般光学性能一般光学性能O返回提供能量激发被测物质将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带，获得所需单色光盛放溶液并提供一定吸光厚度检测光讯号，并将光讯号转变为电讯号迅号放大、数学换算O返回单光束分光光度计光栅吸收池特点：一束单色光要求：光源稳定 校零O返回光栅扇面镜参比池样品池I0II0扇面镜优点：减免光源不稳误差；改变波长不需校零；T=I/I0缺点：不适于浑浊溶液的测定特点：两束同波长单色光O返回单色器1单色器2样品池A=A1-A

12、212特点：两束不同波长单色光优点：无需参比；可测浑浊溶液；可得一阶导数光谱O返回光多道二极管阵列检测器分光光度计 特点：经先后两次分光优点：单色光较纯，杂散光降得很低(溶剂截止波长A尖A平单组分定量分析方法单组分定量分析方法O返回适用：适用：单色光较纯，符合单色光较纯，符合Beer定律定律方法：方法：O返回例例1:VB12 max 361nm:E1%1cm=207,A=0.414,l=1cm，求求C=？g/100ml例例2:样品样品VB1225.0mg1000ml，max 361nm：A，l=1cm，求，求VB12(%)=?C=20 g/mlO返回适用：适用：单色光不纯，不完全符合单色光不纯

13、，不完全符合L-B定律（曲线定律（曲线不过零点，线性稍差）不过零点，线性稍差）方法：方法：标准序列标准序列固定条件固定条件AC曲线曲线样品样品同上条件同上条件AxCx曲线曲线回归方程：回归方程：A=ElC=KCAx校正曲线法示意图CxO返回例3:芦丁的含量测定:标准品(0.200mg/ml)05ml25ml 样品3.0mg25ml回归方程：AC (r=0.9996)O返回适用：适用：线性关系较好线性关系较好要求：要求：相同测定条件相同测定条件 Cs与与Cx相近相近方法：方法：对照法示意图As=ECsl；Ax=ECxl O返回例4:VB12的含量测定VB12注射液：对照品溶液：25.00mg 1

14、000mLmax 361nm:l=1cm,Ax=0.508,As=0.518,求C=?对照法：吸光系数法：CCO返回酸式体：酸式体：AHA=HAC碱式体：碱式体：AA-=A-CA=AHA+AA-=HAHA+A-A-O返回例5:吸光度法求VB6的pKaVB625mg100ml贮备液，l=1cm，pH=2:酸式体max 230375nmpH=7:碱式体O返回 数值计算计算分光光度法数值计算数学变换条件：符合Beer定律、满足吸光度加合性、各组分吸收光谱有较大差异数学模型：A=KC方法：图解法（等吸收双波长消去法、系数倍率法）、信号处理方法、矩阵解法 O返回吸收峰互不重叠 a、b互不干扰吸收峰部分重

15、叠a对b干扰，b对a无干扰 1：A1a单组分定量Ca=A1a/E1al 2：A2a+b=A2a+A2b=E2aCal+E2bCbl 1：A1a单组分定量Ca=A1a/E1al 2：A2b单组分定量Cb=A2b/E2blO返回吸光度加和性适用：浑浊溶液、吸收光谱重叠的混合组分原理：双波长型分光光度计A=A2-A1=(21)Cl=KC干扰组分干扰组分b：Ab=A1b-A2b=0待测组分待测组分a：Aa较大较大 选择波长选择波长 1和和 2的两个基本条件：的两个基本条件：吸收峰相互重叠a、b互有干扰O返回等吸收双波长消去法示意图（消去b，测定a）2 1A1b=A2b Aa A=A1a+b-A2a+b

16、=A1a+A1b-A2a-A2b=A1a-A2a=Aa=(E1a-E2a)Cal=EaCal=KCa数学运算：数学运算：ACaO返回等吸收双波长消去法示意图（消去a，测定b）2 1A1a=A2a Ab A=A1a+b-A2a+b =A1a+A1b-A2a-A2b=A1b-A2b=Ab=EbCbl=KCb数学运算：数学运算：ACb优点：无需空白参比，可消除本底吸收及浑浊干扰，显著提高测定灵敏度和准确度。O返回适用：干扰组分无合适等吸收波长或不呈峰形&掩蔽系数K=A1/A2 A=KA2A1=0 优点：待测组分信号同时放大，Ax增大，提高检测灵敏度。原理：一般K放大57倍O返回系数倍率法示意图系数倍

17、率法示意图待测组分待测组分 2 1A1yA2yKA2yA1y/A2y=K KA2y=A1y 1：A1=A1x+A1y 2：A2=K(A2x+A2y)干扰组分干扰组分y：Ay=KA2yA1y=0 A=A2A1 =K(A2x+A2y)-(A1x+A1y)=KA2x-A1 x+(KA2y-A1y)=AxCxl=(KE2x-E1 x)Cxl=KCx 干扰组分干扰组分=ACxO返回应用：定性鉴别、结构分析及痕量测定原理：A=f()C一阶导数光谱(A/-)：(A/)i=(Ai+1Ai)/(i+1-i)二阶导数光谱(2A/2-)：2A/2=(A/)/对普通光谱原函数求导所得图象。O返回零阶光谱的极大在奇数阶

18、为0，偶数阶为极值（极大、极小交替出现）。导数光谱的优点：突出特征，增加信息量，分辩率提高，消除杂质干扰。零阶光谱的拐点，在奇数阶为极值，偶数阶为0。阶数n增高，极值数目增加(n+1)，峰形尖锐，分辨率增高。高频信号随导数阶数增高而增大；低频信号（干扰组分）反之通过对吸收曲线求导，消除干扰。极大极大00极小拐点极小极大00O返回导数光谱法对干扰吸收的消除 比尔定律：A=C(l=1cm)一阶导数：dA/d=(d/d)C二阶导数：d2A/d2=(d2/d2)C三阶导数：d3A/d3=(d3/d3)C导数信号CA=C0+C1+C22+C33+Cnn A=C1+C2+C32+C43+Cnn-1 微分级

19、数消除阶次较低的背景干扰 微分对求导吸光系数在特定波长下的变化率O返回采用导数光谱上适宜振幅作为定量信息 导数光谱的求导定量方法：标准对比法求导条件：单色光的谱带宽度(狭缝宽)；波长间隔 p.峰谷法d.基线法(正切法)z.峰零法导数阶数：二至五阶。阶数分辩率抗干扰性S/N。奇数阶导数光谱易分辨，利于鉴别；偶数阶导数光谱易得到极值，利于测定。几何法代数法 O返回导数光谱法检定乙醇中痕量苯定性鉴别定性鉴别定量分析定量分析空白醇的吸收光谱空白醇的吸收光谱醇中含苯醇中含苯1ppm的吸收光谱的吸收光谱醇中含苯醇中含苯10ppm的吸收光谱的吸收光谱醇中含苯醇中含苯10ppm的二阶导数光谱的二阶导数光谱醇中

20、含苯醇中含苯10ppm的四阶导数光谱的四阶导数光谱含苯胺和苯酚含苯胺和苯酚5ppm的吸收光谱的吸收光谱含苯胺和苯酚含苯胺和苯酚5ppm的四阶导数光谱的四阶导数光谱FNC(苯胺苯胺)DCC(苯酚苯酚)导数光谱法测定废水中苯胺和苯酚的含量O返回)显色反应的类型：配位反应、氧化还原反应、缩合反应、重氮化偶合反应M显色反应的要求化学计量关系确定组成恒定，化学性质稳定选择性好(max60nm)试剂和产物的吸收区别明显(max60nm)灵敏度高(=103105)：对能吸收可见光的有色溶液进行测定的方法。O返回试剂（显色剂）：灵敏度、稳定性、选择性用量：一般过量；影响产物组成 NH4SCN作显色剂测Fe3+

21、：Fe3+SCN-Fe(SCN)2+淡红色：Fe3+2SCN-Fe(SCN)2+淡血红色：Fe3+4SCN-Fe(SCN)4-血红色 溶剂控制：条件实验(A-C)影响物质对光的吸收显色反应产物稳定性控制：有机溶媒可提高生成物稳定性O返回酸碱度 酸度过大：影响配合物离解酸度太小：金属离子水解沉淀不同pH范围：生成配合物颜色不同控制：条件实验(A-pH)；缓冲溶液 时间 时间太短：反应不完全时间太长：有色配合物再次分解控制：条件实验(A-t)温度 影响反应速度合适温度：促使正反应迅速完全；防止副反应发生控制：条件实验(A-T)O返回单组分定量分析方法单组分定量分析方法吸光系数法吸光系数法校正曲线法

22、校正曲线法对照法对照法多组分定量分析方法多组分定量分析方法双波长法双波长法导数光谱法导数光谱法光电比色法光电比色法（单色光较纯）（单色光较纯）（单色光不纯）（单色光不纯）（线性关系较好）（线性关系较好）（等吸收双波长消去法、系数倍率法）（等吸收双波长消去法、系数倍率法）（显色反应条件）（显色反应条件）O返回定性鉴别的一般方法（光谱比较法）定性鉴别的一般方法（光谱比较法）纯度检测方面的应用纯度检测方面的应用 有机化合物结构研究有机化合物结构研究O返回定性鉴别的依据：定性鉴别的依据：吸收峰数目吸收峰数目吸收峰位置吸收峰位置 max吸收峰强弱吸收峰强弱 max吸收光谱形状吸收光谱形状吸收光谱的特征吸

23、收光谱的特征定性鉴别的一般方法：标准对比法定性鉴别的一般方法：标准对比法比较光谱特征数据比较光谱特征数据 max、min、sh 比较比较A（或（或 max）的比值）的比值比较光谱一致性比较光谱一致性 O返回安宫黄体酮安宫黄体酮(M=386.53)炔诺酮炔诺酮(M=298.43)max=2401nm max=2401nm3344O返回适用：存在几个吸收峰的样品，可消除仪器、浓度、厚度或其它原因造成的误差。V-B12鉴别：max=278、361、550(nm)中国药典规定：A361/A278 A361/A550=3.153.45 O返回三种甾体激素的紫外吸收光谱三种甾体激素的紫外吸收光谱(10 g

24、/ml甲醇溶液）甲醇溶液）醋酸泼尼松醋酸泼尼松醋酸氢化可的松醋酸氢化可的松醋酸可的松醋酸可的松O返回杂质检查吸收峰位置：化合物无吸收杂质有吸收检出吸光系数变化：化合物强吸收吸收光谱变形 杂质无(弱)吸收吸光系数杂质吸收更强吸光系数O返回吸光度上限值 HOHOCOCH2CH2NHCH3HOHOHC CH2CH2NHCH3OH肾上腺酮肾上腺素肾上腺素与肾上腺酮的紫外吸收光谱max=310nm肾上腺酮肾上腺素O返回 峰谷吸光度比值 药典规定：C=2mg/ml,l=1cm,max杂质吸收峰处无(弱)吸收吸收谷处有吸收O返回Y有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱 饱和碳氢化合物：饱和碳氢化合

25、物：*，短，远紫外区短，远紫外区化合物化合物 max(nm)*n*CH3OH 150180CH3Cl 157173CH3I 180255O返回孤立双键：CH2=CH2(max=193nm)共轭双键：CH2=CHCH=CH2(max=220nm,104)EE最低占有轨道最高空轨道跃迁几率C=C 共轭 C=C(*);EO返回孤立助色团：n*跃迁，长孤立生色团：n*(275295nm),n*(190nm),*(150180nm)、-不饱和醛、酮、酸和酯 共轭C=C：K带(max=200260nm，104)C=O：R带(max=310350nm，NHCOCH3O-NH2OCH3 OHBr Cl CH3

26、间位定位基：NO2CHOCOCH3COOHCOO-,CN-SO2NH2NH3+w对位二取代 200nm 381nm，=181nm52+30=82nm 265nm，只比硝基苯(252nm)长13nm O2NNH2HOOCNO2NO2NH2邻、对位基间位基252nm,=52nm 230nm,=30nm O返回HONO2HONO2NO2OH 317.5nm 273.5nm 278.5nm 芳杂环类（五元或六元）：饱和：max(平伏键）平伏键）共轭共轭 O返回紫外吸收光谱一致：具有相同的生色团 VK1 1，4-萘醌 max(nm)249，260，325 250，330lg ，3.8 O返回水合氯醛可能

27、有两种结构：C CClClClHOH2O(1)C CHClClCl(2)OHOHR带，290nmO返回掌握掌握 基本概念：基本概念：电子跃迁类型、生色团与助色团、透光率与电子跃迁类型、生色团与助色团、透光率与吸光度吸光度基本理论：基本理论：吸收带吸收带类型、特点及影响因素类型、特点及影响因素Lambert-Beet定律定律的物理意义、数学表达式及偏离因素的物理意义、数学表达式及偏离因素吸光系数吸光系数的物理意义、表达形式及其相互关系和有关计的物理意义、表达形式及其相互关系和有关计算算紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法单组分定量单组分定量的各种方法的各种方法 O返回紫外紫外-可见分光光度计的基本部件、工作原理及可见分光光度计的基本部件、工作原理及光路类型光路类型紫外紫外-可见分光光度法多组分定量方法可见分光光度法多组分定量方法用紫外吸收光谱进行定性鉴别及纯度检测的各种用紫外吸收光谱进行定性鉴别及纯度检测的各种方法方法 熟悉熟悉光电比色法的原理及应用光电比色法的原理及应用紫外吸收光谱与有机物分子结构的关系紫外吸收光谱与有机物分子结构的关系 了解了解O返回教材P226思考题与习题：1、3、4、12、13、14、16