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1、实验七 细胞骨架微丝的 光学显微观察,实验目的 微丝概述 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 下一次实验预告,实 验 目 的,掌握用考马斯亮蓝R250染色观察植物细胞内微丝的方法。,细胞骨架的观察,微丝概述,细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。 狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）、中间纤维（intermediated filament，IF）。细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑
2、结构，决定细胞的形状，而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。观察骨架方法？,实 验 原 理,本实验观察由微丝平行组成的纤维束，当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250染色可看到沿细胞一定方向伸展的纤维束。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝，实验中用1%Triton X-100抽提掉胞质中的蛋白（除骨架蛋白外），能清楚地显示微丝束呈深兰色。（？） Mg2+ 高浓度Na+ K+诱导 G-actin F- actin 含ATP Ca2+ 低Na+ K+,细胞骨架的观察,仪器、材料与试剂,仪器：光学显微镜 材料：植物洋葱 每
3、二人一套的用具:平皿或试管，镊子 、吸管； 每人一套的用具:载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记 ) 盖玻片、吸水纸等。 试剂 (1) 磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH .）， (2) 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）， (3) M-缓冲液， (4) 1Triton X-100（用M-缓冲液配） (5) 0.2%考马斯亮蓝R250， (6) 3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）,细胞骨架的观察,M缓冲液配方,咪唑（Ph6.7） 3.4g KCl 3.73g MgCl26H2O 0.10g EGTA 0.38g EDTA2H2O 0.04g 巯基乙醇 70l 甘油 29
4、4.8ml 水定容 1000ml,实 验 步 骤,1）取PBS液4ml培养皿中,再驳取洋葱鳞茎内表皮约1cm2若干片，放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器）。 2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100 4ml处理洋葱表皮25-40 min。 3）除去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10 min 4）加3.0%戊二醛固定液4ml（用0.2 mol/L的磷酸缓冲液pH 6.8配制） 固定0.5h 。 5）用PBS洗3次，滤纸吸去残留液体。 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。 7）用蒸馏水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。 9）结果：微丝束呈深蓝色,细胞骨架的观察,实 验 报 告 及 思 考 题,1 画出所观察到的微丝图像。 2 说明在实验中1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？ 3 说明M-缓冲液的作用是什么？,细胞骨架的观察,光镜下显示细胞骨架：,红色显示微丝，绿色显示微管,2.植物组织培养:外植体的培养诱导与观察,下次实验：,1.小鼠骨髓染色体的制备观察,
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