工业微生物 chap3 微生物的生长繁殖及其控制

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1、第三章 微生物的生长繁殖及其控制 微生物的生长繁殖是一个复杂的生命过程。微生物的生长(growth)是指微生物通过新陈代谢把营养物质转变成细胞物质，个体重量增加的过程。生长是微生物个体从小到大的增长，随着菌体重量的增加，菌体数量也会增多，这就进入了繁殖阶段。繁殖(reproduction)是指细胞生长到一定程度进行分裂产生同亲代相似的子代细胞的过程。繁殖导致微生物个体数量的增加。从生长与繁殖的关系来看，生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。但是在结构简单的微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终是交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清, 因此实际上常以群体生长作为衡量微生物生长的指标。微生物群

2、体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 = 个体生长 +个体繁殖除了特定的目的以外, 在微生物的研究和应用中, 只有群体的生长才有实际的意义, 因此， 在微生物学中提到的生长，均指群体生长。这一点与研究动物、植物时有所不同。微生物的生长繁殖是在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、变质微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关，所以对微生物的生长繁殖及其控制的规律的介绍十分必要。第一节 微生物的生长繁殖一、 微生物生长繁殖的

3、测定既然微生物的生长意味着细胞物质的增加，那么测定生长的方法也都直接或间接地以此为基础，而测定微生物的繁殖则以计量数目为基础。（一）细胞物质总量测定测定细胞物质总量的方法很多，适用于所有微生物。1直接测定法直接测定法包括粗放的体积测定法和比较精确的干重称量法。（1）体积测定法。通常将待测定的培养液放置在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，观察沉降物的体积。（2）干重称量法。采用离心法或过滤法获得菌体，然后烘干至恒重，称量。一般干重为湿重的10%20%。 2生理指标法与微生物生长量平行的生理指标较多，可根据实际情况加以选择。常用的如含氮量测定法（一般细菌的含氮量为12.5%，酵母菌为7.

4、5%，霉菌为6.5%，粗蛋白总量含氮量X6.25）。另外，还可以测定含碳量、含磷量及DNA、RNA和ATP的含量。微生物生长过程中的产酸、产气、耗氧、黏度和产热等生理指标也可用于细胞物质总量的测定。（二）微生物细胞数的测定1直接计数法直接计数法适用于单细胞的细菌、酵母菌、原生动物和霉菌孢子等的计数。显微计数法是广泛使用的方法，有各式各样用来计算菌数的计数器。对酵母用Thoma血球计数板，对细菌用Petroff-Hausser计数器或Helber计数器。这些计数器的底面都有棋盘式刻度，可以对一定面积内的微生物进行计数。图3-1是利用Petroff-Hausser计数器对细菌计数的示意图。图3-1

5、 Petroff-Hausser计数器对细菌进行直接显微计数 直接计数法比较常用，但得到的结果是包括死细胞在内的总菌数。目前已有用特殊染料作活菌染色后再用光学显微镜计数的方法。例如，用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，而死细胞为兰色，可作分别计数；细菌用吖啶橙染色后，紫外显微镜下观察到活细胞发出橙色荧光，而死细胞发出绿色荧光。2平板菌落计数法平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混和，或用菌液涂布于已凝固的固体培养基上。经保温培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘以菌液的稀释倍数，即可算出原菌液的含菌数。在一个cm的培养皿平板上，一般以出现

6、30300个菌落为宜。图3-2是平板菌落计数法系列稀释与菌落计数的示意图。图3-2平板计数与系列稀释注意，平板菌落计数法对产甲烷菌等严格厌氧菌的计数不适用3含量测定法与DABAHCl（浓度的，二氨基苯甲酸盐酸溶液）能显示特殊的荧光，根据此原理测出含量，即可推算出细菌的总数。每个细菌平均含.4X10-14g。4比色（比浊）法细菌（酵母菌）培养物在生长过程中，由于细胞物质的增加，会引起培养物混浊度的提高，因而可用比色（比浊）法测定菌液的透光度，从而得出细胞总数。二、 微生物的生长规律（一） 微生物个体细胞的生长细菌、酵母菌、霉菌等工业上常见的微生物的生长模式各不相同。细菌在分裂的一个周期内，细胞质

7、量与所有细胞组成均成倍增加，分裂所得的两个子代细胞与母细胞完全相同。图3-3酿酒酵母的细胞周期霉菌的生长特性是菌丝伸长与分枝，从菌丝体的顶端通过细胞间的隔膜进行生长。一旦细胞形成，就会保留其完整性，并有一个相对与邻近细胞的菌龄。菌丝体既可以是长的和分散的，也可以是短的和高度分枝的，或者是两者的混合形式。当霉菌生长在培养基表面时，菌丝体盘结交叉，形成菌落；在深层培养时，菌丝体多数情况下形成菌丝团，有时也可以分散的菌丝形式存在。酵母菌是真菌，主要通过出芽方式繁殖，少数酵母菌也可通过分裂来生长。酵母菌的生长可分为四个时期:G1、S、G2和M期（如图3-3）。S和M期分别指DNA合成期和有丝分裂期，G

8、1和G2期分别是S和M期之间的间歇期。（二） 微生物群体生长的规律微生物群体生长的规律，依据培养方式、微生物种类等的不同而变化，在分批培养、连续培养及同步分裂培养时其生长规律有明显差别。1。分批培养将少量细菌培养物接种到一定的恒容积液体培养中进行分批培养，由于培养过程中没有新鲜培养基的加入，因而营养物质的浓度逐步下降，代谢废物的浓度不断增加，微生物的生长速度随时间发生有规律性的变化。（） 细菌的典型生长曲线根据细菌生长速率常数的不同，一般可把细菌的典型生长曲线粗分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期等四个时期（图3-4）。图3-4细菌的群体生长曲线I延迟期 II对数期 III稳定期 IV衰亡期 延

9、迟期(lag phase) 延迟期又称停滞期、调整期或适应期。这是培养基接种后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入到新的培养环境时，必须重新调整其体内的分子组成，包括酶和细胞结构成分，因而又称调整期。延迟期的微生物有下列生理特性：a.菌体内物质量显著增长，菌体体积增大，杆菌则表现为菌体明显伸长；b.代谢活跃。表现为细胞内RNA含量增高，原生质的嗜碱性增强，对氧的吸收、的释放及脱氨作用也很强，容易产生各种诱导酶，细胞生长速度逐渐加快；c.对外界不良环境条件如食盐浓度、温度、辐射及抗生素等化学药品的反应敏感。延迟期的长短与菌种、菌龄、培养条件等密切相关。用合适种龄的种子、适宜的培养基或增大接种

10、量可以缩短延迟期。 对数期（logarithmic phase）对数期又称指数期。对数期是指细菌经过对新环境的适应阶段后，细胞数以几何级数增加的阶段。对数期微生物的生理特征是：a.细胞高速生长繁殖。因为这时养分充足，而排出的代谢废物还不足以影响生长繁殖；b.温度影响细胞的生长繁殖速度，接近最适生长温度则速度快；c.处于对数期前期的细胞对理化因素仍比较敏感，而且菌体大小均匀，单个存在的细胞占多数。因此在研究细菌的代谢和遗传特性时，使用这个时期的细胞较佳；d.用处于对数期后期的细菌接种合适的发酵培养基可以缩短延迟期。对数期内细菌细胞数目以稳定的速率按几何级数增加，因此根据细胞增加的总数可以计算出细

11、胞每分裂一次所需要的时间（世代时间，以表示，亦称菌体倍增时间）。若对数期t1时的菌数为N，由于细菌是分裂繁殖，所以经过n次裂殖后t2时的菌数NNXn即：lgN2=lgN1+nlg2繁殖代数n=( lgN2-lgN1)/lg2世代时间G=(t2-t1)/n所以：G=(t2-t1)lg2/( lgN2-lgN1 ) 稳定期（stationary phase）稳定期又称平衡期或恒定期。由于营养物质的逐渐消耗和有生理毒性的代谢物质在培养基中的积累，以及其它条件（如pH、氧化还原电位等）对细菌生长不利的改变，到对数期的末期，细菌分裂速度降低，繁殖率和死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定，从而进入稳定期

12、。稳定期微生物的主要生理特征为：a.细胞分裂速率降低，细胞质内累积细胞贮存物，如糖原、脂肪粒、多聚羟基丁酸和多聚偏磷酸盐等。大多数产芽孢细菌则在此时产生芽孢；b.代谢活动继续进行，并保持相当水平。微生物的稳定期可以持续相当长的时间；c.稳定期的长短因菌种和培养条件而异。由于稳定期是积累代谢产物的重要阶段，生产上常常通过补加养料、调节pH、调整温度等措施来延长稳定期，以积累更多的发酵产物。 衰亡期(decline phase)稳定期后期，由于营养缺乏、代谢废物堆积会使细菌死亡速度超过繁殖速度，活菌数明显下降，从而进入衰亡期。衰亡期微生物的生理特征为:a.细胞内颗粒更明显，出现液泡，细胞出现多种形

13、态，包括畸形和衰退形；b.因细菌本身所产生的酶和代谢产物的作用而使菌体分解死亡；c.衰亡期与其它各期相比相对较长，其时限取决于细菌本身的特性及环境条件。以上是细菌正常生长所经过的各个生长期。酵母等单细胞微生物的生长情况基本类似。工业发酵过程，特别是生产初级代谢产物的发酵过程一般只经过前面三个阶段，若生产菌体产品也可能只经过前面两个生长阶段。（） 丝状真菌的生长曲线在液体培养或深层培养中以菌丝干重作为衡量的指标，丝状真菌的生长过程大致可分为下列三个阶段： 生长停滞期。造成生长停滞期的原因有两种：一是孢子萌发的真正的停滞期；另一种是生长已经开始但却无法测量。 迅速生长期迅速生长期内菌丝体干重迅速增

14、加，其立方根与时间呈直线关系。真菌的生长常常表现为菌丝尖端的伸长和菌丝体的分枝，因此受到邻近细胞竞争营养物质的影响。在迅速生长期中，碳、氮、磷等被迅速利用，呼吸强度达到顶峰，代谢产物（如酸类）可能出现。在静止培养时，迅速生长期的后期的菌膜上将出现孢子。 衰退期真菌生长进入衰退期的标志是菌丝体干重下降。一般在短期内失重很快，以后则不再变化，但有些真菌则发生菌丝体自溶。处于衰退期的菌丝体的细胞，除顶端较幼龄的细胞的细胞质稍稍稠密外，大多数细胞都出现大的空泡。在固体培养基上，真菌菌落发育的情况是在停滞期之后就以恒定的速度生长。J.Nicklin等人认为真菌在给定的培养基上生长经过停滞期、对数期、线性

15、期、减速期、稳定期和衰退期（如图3-5）。图3-5真菌的生长曲线1-停滞期 2-对数期 3-线性期 4-减速期 5-稳定期 6-衰退期。连续培养 将微生物置于一定容积的培养基中，经培养后一次收获，这种培养方式称为分批培养。在分批培养中，微生物所处的环境在不断变化，营养物不断消耗，代谢产物不断积累，使微生物不能长久地停留在对数生长期。若改变培养方法，在对数生长期的培养容器内不断添加新鲜培养基，同时不断放出培养物，从而使微生物所需营养能及时得到补充，有害的代谢产物及时排除，菌体生长不受影响，始终维持在对数生长期，这种培养方法称为连续培养。 根据连续培养器串联的数目多少，可将连续培养的形式分为单级连

16、续培养和多级连续培养。以获取菌体或与菌体相平行的代谢产物（如酒精，乳酸）为目的者，只要用单级连续培养法就可以满足。如果为了获得次生代谢产物（如抗生素、维生素等），则采用多级连续培养法较合适，这时在第一级发酵罐中以培养菌体为主，后几级则以产生大量代谢产物为主。最简单的连续培养装置包括：培养室，无菌培养基储存器和调节流速的控制系统。必要时还装有通气，搅拌装置（图3-6）。图3-6连续培养装置培养基容器控制流速阀培养室排出管光源光电源 控制单级连续培养方法有两种：恒化培养和恒浊培养。 （）恒化培养 通过流加方式，及时补充微生物所消耗的营养物质，使培养室中的营养物浓度基本恒定，故称恒化连续培养，亦称恒

17、成分连续培养。 在恒化培养中，必须将某种必需营养物限制在较低的浓度，以作为生长限制因子，而其余营养物均需过量，使微生物生长速率主要取决于限制因子。用不同浓度的限制性营养物进行恒化连续培养，可以得到不同生长速率的培养物。常用来做生长限制因子的有作氮源的氨、氨基酸；作碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；生长因子和无机盐也可用来做生长限制因子。 恒化连续培养多用于科研工作中。在遗传学研究方面，利用它作长时间培养，以便从中分离不同的变种。在生理学方面，利用它来观察微生物在不同培养条件下的生理变化。恒化培养也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型，因为生长在自然界的微生物一般是处于低营养浓度条件下，而

18、恒化培养正好可通过调节系统来维持培养基中某成分的低浓度状态，使之与自然条件类似。 （）恒浊培养 不断调节流速而使培养物的浊度保持恒定的连续培养称为恒浊连续培养，又称恒浓度连续培养。在恒浊培养中装有浊度计，借光电检测培养室中菌液的浓度，并由光电效应所产生的电流信号变化来自动调节培养基流进和培养物流出的流速。当培养室中浊度超过预期浓度时，流速加快，浊度降低；反之流速减慢时浊度增大，借此来维持培养物浊度，使之始终保持在同一水平。恒浊培养中，微生物生长速率主要受流速控制，但也和菌种类型、培养基组分以及培养条件有关。 恒浊连续培养，可以不断提供具有一定生理状态的细胞，得到以最高生长速率进行生长的培养物。

19、对于以获取大量菌体为目的的工业化生产来说，利用此法可取得较好的经济效益。 连续培养法在我国已用于厌氧发酵，如乙醇、丙酮丁酮的发酵生产中，在国外应用更广泛。连续培养的最大优点是取消了分批培养中各批之间的时间间隔，从而缩短了发酵周期，提高了设备利用率。另外，连续发酵便于自动控制，降低劳动强度。但连续发酵中杂菌污染和菌种退化问题比较突出，应引起注意。 3。同步分裂培养同步分裂培养又称同步生长。同步分裂培养主要用于微生物生理方面的研究，以及遗传育种。通常在对数生长期中的所有细胞也并不是同时分裂的，有的分裂早，有的分裂晚。因此，细胞的“年龄”是不一致的，这就给研究细胞个体的生长带来了困难。目前已有办法诱

20、使培养物中的细胞进行同步生长，如图3-7所示。有一类方法是改变环境条件，促使培养物中的细胞同步生长。常用的方法是在最适生长温度和低于或高于最适生长温度之间改变培养的温度。例如先将鼠伤寒沙门氏菌在25下培养28 min，然后在37培养8 min，这样重复几次，就可使这种菌在37时进行同步分裂。图3-7大肠杆菌的同步生长改变培养基的成分也可以使某些微生物进行同步分裂。如将需要某种生长因素的微生物先在不含该种生长因素的培养基中饥饿一段时期，再转移到完全培养基中培养，可诱使细胞同步分裂。此外，用交替见光和黑暗处理光合细菌，或者在培养基中加入能够影响细胞周期中主要功能的代谢抑制剂（如蛋白质合成的抑制剂氯

21、霉素），也能诱发同步分裂。诱使同步分裂的方法都会干扰细胞的正常代谢，因为是在非正常的条件下迫使细胞同步分裂的，而且有关的生化基础了解得也很少。另一类是用机械方法选出大小一样的细胞后加以培养，也可获得同步分裂的培养物。常用的方法有两种：一种是将微生物通过孔径不同的滤膜过滤选出一定大小的个体；另一种是用密度梯度离心法分离微生物，小细胞分布在密度小的上层，可以吸出，培养在新鲜培养基中。它们可以同步分裂34代。这种方法常用于酵母（用蔗糖或糊精作介质）。机械方法虽然比较麻烦，但比用改变环境条件的方法较为可取，因为微生物较少受到不正常的物理的或化学条件的影响。无论用哪类方法，每次处理后的微生物最多只能进行

22、同步分裂45代，有时仅一代。这是因为在群体中每个细胞的分裂时间在很大程度上是不一致的，因而不可能得到永远是同步分裂的培养物。尽管如此，用同步分裂的方法来研究个体细胞的生长还是很有用的。可以连续观察细胞大小的变化和取样分析细胞成分的变化。由此所得到的结果，可以免除群体中细胞不均一情况的干扰，因此更能反映细胞个体生长的真实情况。第二节 微生物生长繁殖的营养象其它生物一样，微生物要生长繁殖，就需要不断地进行新陈代谢：吸收营养物质，合成细胞物质，排出代谢废物。微生物从环境中吸取的用来提供能量、调节新陈代谢并合成细胞成分的物质统称营养物(nutrient)。吸收和利用营养物质的过程称为营养过程，又称营养

23、(nutrition)。一、微生物的营养元素（一）、微生物细胞的化学组成与营养元素微生物细胞与其它生物细胞的化学组成类似，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁、锰、铜、钴、锌、钼等化学元素构成（表3-1，表3-2）。这些元素主要以水、有机物和无机盐的形式存在细胞之中。前六种元素（碳、氢、氧、氮、磷、硫）是碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的主要组成分。微生物细胞含水量一般都很高。细菌含水量为75%80%，酵母70%85%，丝状真菌85%90%。除去水分，细胞干物质约占总重量的10%30%，其中碳、氢、氧、氮四种元素表1 微生物细胞中主要元素含量微生物种类在干物质中的含量（）元素细 菌酵母菌

24、霉菌碳50.449.847.9氮12.312.45.24氢6.76.76.7氧30.531.140.2约占全部干重的90%97，其余元素只占3%10%。将细胞干物质高温灼烧成灰，得到各种矿质元素的氧化物（表3-2），通常称为灰分。微生物细胞化学元素的组成量与它们对营养元素的需求量是相一致的，所以在配制微生物的培养基时应包含有组成细胞化学元素的各种营养物质。表2 部分微生物细胞干物质中矿质元素含量元素固氮细菌醋酸细菌酵母菌霉菌P2O54.952.713.544.85SO30.290.0390.11K2O2.411.2812.342.81Na2O0.070.1641.12MgO0.820.480.

25、4280.38CaO0.890.6420.3830.19Fe2O30.080.6240.0350.16SiO20.0360.0930.04CuO0.099（二）、营养要素及其生理功能微生物生长所需的营养元素，少量以气态分子（如H2、N2、CO2）形式提供，大量的是以有机或无机化合物形式提供。根据这些营养物质在微生物细胞中生理功能不同，将它们分为水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等五种营养要素。 1水水是微生物最基本的组成分，在微生物细胞中含量达70%90%，因而水也是微生物最基本的营养要素。水是微生物体内和体外的溶剂，绝大多数营养成分通过水来溶解和吸收，代谢废物通过水进行排泄。水是细胞质组分，直

26、接参与各种代谢活动。此外水的比热高，传热快，有利于调节细胞温度和保持环境温度的稳定。 。碳源 凡可被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳架来源的营养物通称碳源(carban source)。碳源物质通过微生物的分解利用，不仅为菌体本身的合成提供碳架来源，还可为生命活动提供能量，碳源往往也可作能源。微生物细胞物质及其代谢产物几乎都含有碳，所以微生物对碳源的需要量最大，是微生物所需的最基本的营养要素。 可做微生物碳源的物质极为广泛，种类很多。常用的有糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物。微生物的种类不同，利用各种含碳物的能力也不相同。有的能广泛利用各种不同类型的含碳物，如假单胞菌属中的

27、有些菌可利用90种以上的含碳化合物。有的微生物利用碳源物质的能力极为有限，如某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷进行生长。一般地说，对于异养微生物而言，糖类是最好碳源，其中以葡萄糖和蔗糖最为通用；自养微生物则可利用CO2作为生长的主要碳源或唯一碳源。 。氮源 凡能被微生物用于构成细胞物质和代谢产物中氮素来源的营养物称为氮源(nitrogen source)。氮源物质一般不能用作能源，只有少数自养菌能利用铵盐、硝酸盐既作为氮源又作为能源。在特殊环境中如有些厌氧菌在无氧和缺糖时也可用氮源（氨基酸）当作能源用。微生物对氮源的利用可分成以下几类： 能利用N2，NO3-，NH4+，有时也利用有机氮； 能

28、利用NO3-，NH4+和有机氮； 能利用NH4+和有机氮； 只能利用有机氮； 必须利用活体中的有机氮。从以上五种类型中可看出自上而下利用氮源的能力逐渐降低。能够利用无机氮来合成有机物的微生物，称之为氮素自养微生物。凡能利用空气中氮分子的微生物称为固氮微生物。无机盐无机盐(mineral salts)为微生物生长提供必需的矿质元素。矿质元素参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性，维持细胞结构的稳定性，调节细胞渗透压，控制细胞的氧化还原电位，有时可作某些微生物生长的能源物质。由此可见无机盐在调节微生物生命活动中起着重大作用。表3-3 某些无机元素的来源及其生理功能元素来源生理功能PPO43-核酸、

29、核苷酸、磷脂组分参与能量转移缓冲pHSSO2-、H2S、S、S2O32-、有机硫化物参与含硫氨基酸、CoA、生物素、硫辛酸的组成硫化细菌的能源硫酸盐还原细菌代谢中的电子受体MgMg2+许多酶的激活剂组成光合菌中的细菌叶绿素KK+酶的激活剂物质运输CaCa2+酶辅助因子, 激活剂细菌芽孢的组分FeFe2+Fe3+细胞色素组分酶辅助因子，激活剂Fe是铁细菌的能源MnMn2+酶的辅助因子，激活剂ZnZn2+参与醇脱氢酶、醛缩酶、RNA聚合酶及DNA聚合酶的活动NaNa+嗜盐菌所需CuCu+细胞色素氧化酶所需根据微生物对无机盐的需求量通常将无机盐分为主要元素和微量元素两类（表3-3）。磷、硫、钾、钠、

30、钙、镁等元素的盐参与细胞结构物质的组成，并有能量转移、细胞透性调节等功能，微生物对它们的需求量相对大些，为10-310-4mol/L，因而称为主要元素或宏量元素。没有它们，微生物不能生长。铁、锰、铜、锌、钴、钼等元素的盐类进入细胞一般是作为酶的辅助因子，微生物对它们的需求量甚少，一般为10-610-8 mol/L ，因而称为微量元素。微量元素需求量极少，因此混杂在水或其它营养物中的极微数量就足以满足微生物的需要。无特殊原因，一般配制培养基时没有另外加入的必要。生长因子生长因子(growth factors)又称生长因素，是指某些微生物不能用普通的碳源和氮源物质合成，而必须另外加入少量的生长需求

31、的有机物质。按它们的化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物、脂肪酸及其它细胞膜成分等。绝大多数生长因子以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应。不同的微生物需要不同的生长因子。缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”（auxotrophic）微生物，也称营养缺陷型菌株。但有些微生物可合成并分泌大量维生素等生长因子，可作为维生素等的生产菌株。实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等满足微生物对各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁、玉米浆等天然培养基中本身含有各种生长因子，也可作为生长因子的来源添加到其它培养基中。除以上五种营养要素外，有人认为能源也是一种营养要素。 可以为微生物生命活

32、动提供能量的营养物质称为能源物质。能源分为两类：光能和化（学）能。少数微生物可利用光能，大多数微生物是依靠化合物的氧化而获得能量。 可做能源的物质很多, 如NH4+，NO3+, H2S，S，Fe2+，H2等可做某些自养细菌的能源；糖类、脂肪、蛋白质以及它们的各种降解物，烃类、醇类、有机酸等都可以作异养微生物的能源。多数有机物既是能源又可兼做碳源或氮源。比如葡萄糖既是异养微生物的能源，又是碳源；而蛋白质、氨基酸有时则可兼有能源、氮源和碳源3种功能，甚至4种功能（生长因子）。除培养化能自养微生物外，在配制培养基时一般不必专门考虑加入能源物质。二、微生物的营养类型以前，生物学家认为生物只有两种营养类

33、型：以植物为代表的自养型和以动物为代表的异养型。植物能完全靠无机养料生存，动物则需要有机养料。这样简单的分法与微生物营养形式的多样性是不相适应的。人们通常根据微生物所用的能源与碳源的性质对微生物的营养类型进行分类。根据能源的性质不同可把微生物分为光能营养型（phototroph）微生物和化能营养型（chemotroph）微生物。能利用光能通过光化学反应产能的微生物称为光能营养型微生物；必须利用化合物通过氧化还原反应产能的微生物属化能营养型微生物。根据碳源的性质不同可把微生物分为自养型或无机营养型（autotroph or lithotroph）微生物和异养型或有机营养型（heterotroph

34、 or organotroph）微生物。自养型微生物以二氧化碳和非-C=C-键化合物为主要碳源或唯一碳源；异养型微生物以有机物为主要碳源。根据微生物利用碳源、能源的不同把微生物分为四种不同的营养类型。（一）光能自养型微生物光能无机营养型微生物(photolithotroph)，又称光能自养型微生物。它们具有光合色素，既能通过光合磷酸化作用产生ATP，又能以还原性无机化合物（如H2S，Na2S2O3等）为供氢体，还原二氧化碳而合成细胞物质。藻类和某些原核微生物（如蓝细菌）在光照下同化二氧化碳（放出氧）。绿硫细菌和紫硫细菌以H2S或硫代硫酸盐作为还原二氧化碳时的供氢体并得到硫。从广义上讲，光能无机

35、营养型微生物还包括能够或必须利用少量有机化合物（如痕量的维生素）的光能营养微生物。细菌的光合作用与高等绿色植物的光合作用相似，但不放出氧气。（二）光能异养型微生物光能有机营养型微生物（photoorganotroph），又称光能异养型微生物。它们像光能自养微生物一样能够利用光能，但必须以外源有机化合物作为主要碳源和供氢体，在人工培养时通常还需要提供生长因子。如红螺菌科的红假单孢菌属中的微生物，在厌气光照的条件下也能利用有机物迅速增殖。光能异养型微生物能利用低分子有机物迅速增殖，因此可用来处理废水。（三）化能自养型微生物化能无机营养型微生物（chemolithotroph），又称化能自养型微生物

36、。它们能利用无机化合物（如NH3、H2、NO、H2S、S、S2O3、Fe+等）氧化时释放的能量，把二氧化碳中的碳还原成细胞有机物碳架中的碳。某些细菌，如氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillus ferrooidans），可通过氧化硫代硫酸盐及含铁硫化物获取能量。这种细菌氧化黄铁矿可以生成硫酸和硫酸高铁，后者可以溶解铜矿（CuS）实现铜的浸出（生成CuSO4），即为“细菌治金”的实例。化能自养型微生物仅限氢细菌、硫细菌、铁细菌、氨细菌和亚硝酸细菌等五类细菌。这些细菌在产能过程中，都需要大量氧气参加，因此化能自养细菌大多为好氧菌。（四）化能异养型微生物化能有机营养型微生物（chemoorganot

37、roph），又称化能异养型微生物。它们以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中氧化磷酸化提供的ATP而生长。这类微生物的特点是其能源与碳源往往相同，同一种有机化合物的代谢既可供给能量，也可以供给碳架物质。化能异养型微生物包括分类学上的原生动物、真菌和大多数细菌、放线菌等种类。工业上应用的微生物绝大多数属于化能异养型微生物，它们以外界的有机化合物为碳源，在细胞内得到化学能和生物合成材料，实现生长繁殖。微生物的营养类型与特点归纳如表3-4。表3-4微生物的营养类型能 源来自外界的供氢体主要（或唯一）碳源二氧化碳和非-C=C-键化合物有机物光能无机物光能自养型有机物光能异养型化学能无机物化能自养

38、型有机物化能异养型营养类型的划分不是绝对的。在自养型和异养型、光能型和化能型之间，均有一些过渡的类型。例如氢单胞菌（Hydrogenomonas）在完全是无机营养料的环境中，通过氢的氧化获取能量，同化二氧化碳营自养生活；而当环境中有有机物时便直接利用有机物碳架物质而营异养生活。又如红螺菌除了在光照下能利用光能生长外，在暗处的有氧条件下，还可以通过氧化有机物获取能量实现生长，表现为化能营养型。为了避免混乱，一般认为微生物营养型分类以最简单的营养条件为根据，即光能营养先于化能营养，自养先于异养，并以“严格”和“兼性”来描述营养活动性。因此氢单胞菌可被定为“兼性自养型”，而红螺菌则可被定为“兼性光能

39、营养型”。三、微生物吸收营养物质的方式外界的各种营养物质，必须被微生物吸收到体内，才能加以利用，微生物没有特殊摄取营养物质的器官，其营养物质的吸收和代谢产物的排出是靠微生物整个细胞表面的扩散、渗透、吸收等作用来完成的。微生物细胞小，比表面积大，因此表面吸收养料的效率比高等生物高，微生物吸收营养物质以及对各种营养物的吸收速度，均取决于细胞膜的结构和细胞的代谢活动。（一）、细胞膜的生理功能由于微生物的营养过程与细胞质膜有关，人们对细胞膜不断进行研究，提出了各种不同的假说、模型。膜蛋白的研究仍然是分子生物学中非常活跃的领域之一。 细胞膜是一层具有高度选择透性的半透膜，控制营养物质及代谢产物进出细胞，

40、使微生物得以在各种化学环境中吸取它们所需要的营养物质，排出过多的或废弃的物质。细胞膜上有丰富的酶系，如琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、电子传递系统及氧化磷酸化酶系、合成细胞壁组分的酶系及与膜透性有关的酶系。（二）、细胞膜的通透性细胞膜允许物质透过的特性称为通透性。通透性是细胞膜的物理、化学属性，而营养吸收是细胞的生理作用。只有能透过的物质才有可能被细胞所吸收，所以细胞膜的通透性对细胞营养物质的吸收是十分重要的。膜容易透过某些物质而不易透过另一些物质，这种现象称为选择性通透，例如水最容易透过细胞膜，在低渗溶液中水进入细胞，在高渗溶液中水离开细胞，其他各种物质的透性不同，因此，细胞膜

41、具有选择性的通透性。细胞膜的通透性因微生物的种类和菌龄不同而有所差别，一般幼龄菌细胞膜的通透性较大。当细胞受损伤或死亡时，细胞膜的通透性增加，使菌体内容物渗出，细胞的通透性也受各种其他因素的影响而发生变化，如把细胞冻结、溶解或用有机溶剂处理，则可使透性增加，此外pH值、温度、有毒物质等都能影响细胞膜的通透性。细胞质膜对各种营养物质的通透性与营养物质的性质及化学结构有很大关系，营养物质必须是溶质才能透过细胞膜而进入细胞。大分子的化合物（如淀粉、蛋白质、脂肪等）需经过微生物所分泌的胞外酶，水解成小分子的可溶性物质后才能透过。脂溶性物质一般比水溶性质容易透过细胞质膜，它们通过细胞质膜的磷脂部分扩散，

42、碳氢化合物及其他非极性化合物易溶于脂肪或脂肪溶剂，而不溶于水。离子化合物电解质透入细胞较慢，而弱电解质比强电解质透过较快，弱电解质透过细胞质膜的速度随解离度的增加而降低。（三）、微生物对营养物质吸收的机制在微生物中已发现有四种营养物质的运输机制，分述如下： 。单纯扩散（simple diffusion）少数低分子量的物质是靠被动扩散渗入（或渗出）细胞，扩散的速度靠细胞内外的浓度梯度来决定。扩散由高浓度向低浓度，当细胞内外此物质浓度达到平衡时便不再进行扩散。被动扩散的动力来自细胞内外的浓度差。扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。水和一些气体分子(如O2、CO2)等简单化合物可通过单纯扩散

43、透过细胞膜。 。促进扩散（facilitated diffusion）促进扩散与单纯扩散相似，也是靠物质的浓度梯度进行，而不消耗能量，但与单纯扩散不同的是促进扩散需要专一性的载体蛋白存在于细胞膜上，可与相应的营养物结合形成复合物，然后扩散到膜内部，并释放出营养物。革兰氏阴性细菌的细胞质膜表面有很多种分子量较小的蛋白质，用于促进扩散的需要。已从沙门氏杆菌的细胞质膜中分离出了与硫酸盐渗透有关的载体蛋白，其相对分子质量为34，000，每分子硫酸盐与一分子蛋白质专一性结合，这种结合是可逆的，也不需要ATP，这种载体蛋白有时被称为“渗透酶”，其实它并不呈现酶的活性，被运输的分子并不发生变化。已分离出有关

44、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、磷酸、Ca2+、Na+和K等的载体蛋白，它们的相对分子质量介于9，00040，000之间，而且都是单体。促进扩散与单纯扩散的扩散动力相同，来自细胞内外的浓度差。因此，当细胞内外物质浓度达到平衡时便不再进行扩散。 。主动运送（active transport） 主动运送又称主动运输，是细胞质膜的最重要的特性之一，类似于促进扩散过程，但不同的是被运输的营养物或溶质可以逆浓度梯度移动，并且需要消耗代谢能。加入细胞形成能量的抑制剂，如叠氮化物或碘乙酸则可抑制主动运输，而促进扩散和被动扩散不受影响。有许多模式解释主动运送的过程。一般都认

45、为是外界的溶质先与载体蛋白结合，然后此载体和溶质的复合物在细胞膜中由于加入能量而发生某些改变，致使载体对溶质的亲合力降低，而将溶质释放至细胞内，载体又恢复原状而被重复利用。Fox(1972)提出载体是一种变构蛋白质（或称渗透酶），它们在细胞质膜中可以比作是一个能旋的门，这个门有一个口，朝向细胞质膜外，可以和溶质专一性地结合，引起蛋白质变构，使之旋转从而使门口朝向细胞内，由于投入能量（ATP）降低亲合力，而释放出结合的溶质，并使载体恢复原来的构型，又可重复利用。 。基团移位（group translocation）某些细菌自外界吸收特定的糖类，跨膜运输到细胞内部是以其磷酸化的衍生物被释放的形式来

46、进行的，这种运输方式需要能量，类似主动运送，细胞内部的糖的磷酸盐类不能跨膜溢出，这种运输的机制涉及以下反应： 酶I，Mg2+磷酸烯醇式丙酮酸（）r 丙酮酸r 酶r糖 糖6磷酸 丙酮酸总反应式为： 酶磷酸烯醇式丙酮酸糖 糖6磷酸 丙酮酸酶，rHPr是含组氨酸的蛋白质，相对分子质量约为9600，对热稳定。酶I和HPr都是可溶性的，而且是组成性蛋白，其浓度并不因细菌生长在含适合糖的培养基中而增加。无论酶I和HPr都不与糖类结合，因此它们不是载体蛋白，然而催化第二个反应的酶II是一种复合蛋白，它对糖类有高度专一性，而且是诱导生成的，并结合在细胞质膜上。如果当细菌生长在含葡萄糖的培养基中，则诱导生成一种

47、酶II，催化自PHPr转移磷酸基团到葡萄糖上，形成葡萄糖6磷酸（或转移到甘露糖上形成甘露糖6磷酸），如果生长在甘露醇中则细菌生成另一种酶II，将甘露醇转化成甘露醇磷酸衍生物。大肠杆菌吸收葡萄糖是依靠这种方式进行的。在一些真细菌和光合细菌中已发现葡萄糖、果糖和乳糖等的运输是靠这种机制进行的。在严格的好气菌中可能不存在这种运输机制。这种运输机制的优点是：运输的产物是糖6磷酸可以立即进入代谢途径，虽然在运输过程中消耗了一分子，但能量并未浪费，而是有效地保存在糖6磷酸中。对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，嘌呤和嘧啶的输送也是以基团移位的方式进行的。在输送过程中，需借助磷酸核糖转移酶系统将-磷酸核糖焦磷酸分子

48、的磷酸核糖转移到嘌呤或嘧啶分子上，生成的单核苷酸出现在膜内侧。在厌氧型和兼性厌氧型细菌中，脂肪酸、核苷也可通过这种方式运输。以上介绍了营养物质进入细胞的四种跨膜输送方式，实际上一种或多种输送方式可能同时存在于一种微生物中，对不同的营养物进行跨膜运输而互不干扰。图3-8 营养物质进入细胞四种方式比较图另外，有人还在原生动物特别是变形虫中发现营养物质的运输通过膜泡运输（memberane vesicle transport）的方式进行。微生物营养物质的四种运输方式的形象化比较见图3-8。四、微生物的培养基质 人类要利用微生物，首先要培养微生物。要培养微生物，则需要给微生物提供各式各样的营养物质。这

49、种由人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，在微生物学中称为培养基（medium）。（一）培养基的类型 各类微生物对营养的要求不同，科学研究的目的或生产实践的需要也不同，因而培养基的种类很多，迄今为止，已有数千种不同的培养基。为了更好地进行研究，可以根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。 。按培养基组成物质的化学成分区分 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 （1）天然培养基天然培养基（natural medium）是指利用各种动、植物或微生物的原料构成或以其为基础加工而成的培养基。例如培养细菌常用的肉

50、汤蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000ml。天然培养基成分复杂，且不稳定，难以确切知道。 用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物长生旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基和工业上的培养基。 （2）合成培养基 合成培养基（synthetic medium）是一类化学成分和数量完全清楚的物质构成的培养基，是用已知化学成分的化学药品配制而成。例如培养真菌的察氏培养基：蔗糖 30g，K2HPO4 1

51、g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，KCl 0.5g，NaNO3 3g，蒸馏水 1000ml。 合成培养基化学成分精确，重复性强，但价格较贵，而微生物又生长缓慢，所以只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 （3）半合成培养基在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基（semisynthetic medium）。例如马铃薯蔗糖培养基等。如果在合成培养基中加入琼脂，由于琼脂中含有较多的化学成分不太清楚的杂质，故也只能算是半合成培养基。半合成培养基介于天然培养基与合成培养基之间，是两者结合的产物，所以又称综

52、合培养基。半合成培养基能适于大多数微生物的生长代谢，且来源方便，价格较低，在生产实践和实验室中使用最多。 。按培养基的物理状态区分 根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。 （1）液体培养基（liquid medium）配制的培养基是液态的，其中的营养成分基本上溶于水，没明显的固形物。液体培养基营养成分分布均匀，适用于微生物的生理代谢的研究等的要求，更适用于现代化的大规模食品发酵生产。 （2）固体培养基（solid medium）在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。因为它具备了比较理想的凝固剂的

53、条件，例如：一般不易被微生物所分解和利用；在微生物生长的温度范围内能保持固体状态；培养基透明度好，粘着力强等。琼脂的用量一般为2。硅胶是无机的硅酸钠、硅酸钾与盐酸、硫酸中和时凝成的胶体，一般用于分离培养自养菌。琼脂和明胶特性的比较如表3-5。表3-5 琼脂和明胶若干特性的比较化学成分营养价值分解性融化温度凝固温度常用浓度透明度粘着力耐高压灭菌琼脂聚半乳糖的硫酸酯无罕见96C40C1.5%2%高强强明胶蛋白质作氮源极易25C20C5%12%高强弱固体培养基在实际中应用十分广泛。实验室中常被用来进行微生物的分离、鉴定、计数、保藏和生物测定。在工厂中也有固体培养基来培养微生物的，这种固体培养基由固体

54、物料加水或营养盐构成，结构疏松，广泛应用于酱油、白酒、醋等传统发酵产品的生产。 （3）半固体培养基（semisolid medium） 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，则制成半固体培养基。以琼脂为例，用量0.2%1%。这种培养基有时可用来观察微生物的运动、检测噬菌体效价，有时用来保藏菌种。 。按培养基的营养成分是否完全区分根据培养基的营养成分是否完全来区分，可以分为基本培养基、完全培养基和补充培养基。这类术语主要是用在微生物遗传学中。（）基本培养基（minimal medium） 亦称“最低限度培养基”。它只能保证某些微生物的野生型菌株（wild type strain）正常生长，是含有

55、营养要求最低成分的合成培养基，常用“”表示。这种培养基往往缺少某些生长因子，所以经过诱变过的营养缺陷型（auxotroph）菌株不能生长。 （2）完全培养基（complete medium） 如果在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质（如酵母浸出物、蛋白胨等），即加入生长因子而成完全培养基。完全培养基可用来满足微生物的各种营养缺陷型菌株的生长需要，常以“+”表示。 （3）补充培养基（supplemented medium） 如果往基本培养基中有针对性加进某一种或某几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的需要，这种培养基称为补充培养基，常用某种成分如“A”、“B”表示

56、。 。按培养基的用途区分 根据培养基的用途，可分为增殖培养基、选择培养基、鉴别培养基等。 （1）增殖培养基（enrichment medium） 在自然界中，不同种的微生物常常混杂在一起。为了分离所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物生长特别适宜的营养物质，以增加这种微生的生长繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。例如要分离到利用石蜡油进行发酵的酵母菌，在培养基中加入石蜡油，就能达到目的。具体配方如下：(NH4)2HPO4 6g，K2HPO4 2g，酵母膏0.5g，Na2HPO412H2O 0.5g，Zn+、Fe+、Mn+、Ca+微量，石蜡油50ml，加水至1000

57、ml，pH4.85.0。 （2）选择培养基（selective medium） 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的微生物生长繁殖的培养基，称为选择培养基。如链霉素、氯霉素等能抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。在基因工程技术中选择克隆子时也常使用加入某些抗生素的选择性压力培养基。 （3）鉴别培养基（differential medium） 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。

58、例如用以检查饮用水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝（EMB）培养基就是一种常用的鉴别性培养基。在这种培养基上，大肠杆菌和产气杆菌（Aerobacter aerogenes）能发酵乳糖产酸，并和指示剂和伊红美蓝发生结合。结果大肠杆菌形成较小的、带有金属光泽的紫黑色菌落；产气杆菌形成较大的呈棕色的菌落。 有些培养基具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基（Macconkey medium），含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。在这种培

59、养基上，前者菌落为红色，后者菌落为无色（鉴别性）。配方如下：蛋白胨17g，肝蛋白胨3g，三号胆盐1.5g，NaCl 5g，乳糖10g，琼脂17g, 0.5%中性红水溶液5ml,0.1%结晶紫溶液1ml，蒸馏水1000ml。 。按培养基用于生产的目的区分 根据培养基用于生产的目的来区分，可以分为种子培养基和发酵培养基。 （1）种子培养基（seed medium） 种子培养基是为了保证发酵工业获得大量优质菌种而设计的培养基。由于是要提供大量优质的菌种，所以这种培养基营养总是较为丰富，氮源比例较高，有时还有意识地加入使菌种适应发酵条件的基质。例如味精生产菌北京棒杆菌A.S.1299的一级种子（用于摇

60、床培养）培养基配方是：葡萄糖3%，玉米浆2.5%，尿素0.5%，K2HPO40.1%，MgSO40.04%，pH6.77.0。二级种子（1200L发酵罐）培养基配方是：用水解糖3代替葡萄糖3，其它成分都相同。这样做既保证了营养要求，又有利于适应下面的发酵条件。 （2）发酵培养基（fermentation medium） 这是为使生产菌种能够大量生长并能累积大量代谢产物而设计的培养基。发酵培养基的特点是用量特别大。因此对发酵培养基的要求，除了要满足菌种需要的营养外，还要求原料来源广泛，成本比较低。所以这种培养基的成分一般都比较粗，碳源的比例较大。例如柠檬酸发酵用的培养基，就只用山芋粉作原料，浓度

61、高达22，产酸约14。 除上述几类培养基外，还有专门用于培养病毒等寄生微生物的活组织培养基，如鸡胚等；专门用于培养自养微生物的无机盐培养基等。（二）、设计培养基的方法 1。调查研究在具体设计某种培养基时，首先就是要进行调查研究。进行调查研究包括：第一，查阅文献，走访同行，调查前人的工作资料，借鉴别人的经验，寻找有用的东西，以便从中得到启发。例如我国自己生产的井冈霉素（validamycin，主要用于防治水稻纹枯病）、春雷霉素（kasugamycin，主要用于防治水稻稻瘟病，治疗铜绿假单胞菌感染）等抗生素，都是根据有关外文资料的报导，进行定向筛选而得；第二，调查生态，察看“嗜好”，看看微生物喜欢在什么样的环境下生活；喜欢什么样的营养物，然后对“症”下料。例如在含有石油的矿区常存在着可以利用石油的微生物；在含糖量高的花蜜中或果园的土壤中聚集着为数众多的酵母菌；肉汤容易变质发臭，主要是由于腐生细菌生长繁殖的结果；潮湿的麩皮、米糠上特别容易长霉等。在掌握了这些微生物生态知识的基础上，就可以初步设计出简单的、原始的培养基，解决从无到有的问题。例如在一些常用培养其中加进石油，就会很快分离到利用石油的微生物。 2试验比较 根据前人的工作或从调查生态着手，可以初步设计出适合某种